[发明专利]基于DNA信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了基于DNA信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下：（1）将石墨烯溶于醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散得到石墨烯分散液；（2）将磷酸缓冲液、延伸后的DNA反应液和硝酸银水溶液溶于二次蒸馏水于PCR管中混合均匀，然后冰浴孵育使银离子与DNA相结合，再加入硼氢化钠水溶液，持续振荡使银离子被还原后，室温下避光反应得到银纳米簇；（3）将石墨烯电沉积到裸玻碳电极，再滴加DNA‑AgNCs溶液，避光组装冲洗即可，可用于检测过氧化氢和TdT酶浓度，优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠、成本低。

技术领域

本发明涉及电化学传感器，尤其是涉及一种基于DNA信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用。

背景技术

过氧化氢是自然界中常见的物质，它在环境、工业、生物技术食品和临床诊断分析领域起到重要的作用。过氧化氢自身具有细胞毒性，对激活免疫细胞、细胞凋亡等生物过程会产生一定的影响；许多催化氧化还原酶的中间物质和最终产物为过氧化氢；在工业生产中，过氧化氢的氧化、漂白、消毒及脱氯等特性，使其被广泛应用于纺织、造纸、食品及有机合成领域。因此开发一种快速、高效的过氧化氢检测技术显得尤为重要。

脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)是一种不需模板就可以催化脱氧核苷酸(dNTP)结合到DNA分子3′-OH的DNA聚合酶，使DNA链延伸。基于TdT在生物体系中的活性随着组织细胞变化而不同，可以通过检测TdT在特定组织细胞中的含量以达到对某些疾病进行诊断的目的。TdT作为一种新型的工具酶，不仅具有无需模板聚合的特点，还可以利用其对DNA或RNA分子进行分子信号标记，这些特点使得TdT在DNA生物传感技术、DNA纳米技术以及基因芯片技术中具有广阔的应用前景。传统的TdT检测分析主要依靠凝胶电泳分析。但凝胶电泳分析操作过程复杂、耗时长、费用昂贵、重现性较差，且只能给出半定量的结果。因此，开发一种简便、灵敏、低成本、选择性好的TdT检测手段势在必行。

银纳米簇(AgNCs)的尺寸约为1nm左右，由几个到几十个原子组成。AgNCs具有导电性能好、无生物毒性且生物兼容性好等特点，因此广泛应用于电化学免疫传感技术领域。用于合成AgNCs的稳定剂和模板有很多，常见的包括聚合物、巯基小分子、多肽以及蛋白质，但是最为常用的是DNA。DNA是一种长链生物聚合物分子，它由四种脱氧核糖核酸组成。含胞嘧啶(C)数目较多的DNA中可以有效结合银离子，然后通过加入NaBH₄还原即可得到被DNA包裹的AgNCs(DNA-AgNCs)。相比于聚合物、小分子、多肽或蛋白质为模板合成的AgNCs，DNA-AgNCs的合成更为简单。

目前关于DNA信号放大的技术主要有：聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增反应(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)及DNA机器人技术。但这些方法存在耗时长、成本高、需要特定的热循环仪器、操作复杂等不足。本发明利用脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA信号放大，属于链聚合扩增技术。TdT是一种性质独特的DNA聚合酶，可以催化单链DNA的3′-OH端与三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dCTP)结合，生成含胞嘧啶数目较多的DNA链，过程中不需要模板，DNA链上的胞嘧啶继而捕获溶液中的银离子，通过NaBH₄还原，合成DNA包裹的银纳米簇(DNA-AgNCs)，整个过程操作相对简单、成本低廉。

电化学生物传感器结合了电化学的强大分析功能、特异性识别生物性能，将生物反应的化学信号转换为与被分析物质浓度有关的电信号，从而达到检测目的。电化学生物传感器以其具备快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等优点被广泛运用。以DNA为模板信号放大合成的银纳米簇(DNA-AgNCs)，由于其本身良好的导电性、催化性能及生物兼容性，非常适合用于开发电化学生物传感器。