[发明专利]用于检测转基因大豆的引物和探针组合、检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法。

背景技术

2015年是转基因作物商业化20周年，全球转基因作物种植面积高达1.797亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍，已成为现代农业史上采用最为迅速的作物技术。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜等，其中全球种植面积最大的为转基因大豆，约占全球转基因作物总面积的一半。虽然我国还没有批准任何转基因大豆品系进行商业化种植，但我国已经成为转基因大豆的使用与消费大国，产品越来越多地进入了我国的食品生产与消费链，2015年转基因大豆的进口总量已达到8000万吨。

转基因大豆DAS81419是由美国陶氏益农研发的一种转基因大豆品系，含有两个抗虫基因Cry1Ac、Cry1F和一个抗除草剂基因pat，2014年美国和加拿大批准环境释放作为食品和饲料应用，但目前还没有获得我国转基因生物安全证书。2015年，中国进口大豆8169万吨，是全世界最大的大豆进口国，其中大部分为转基因大豆，主要来源于美国和巴西。然而，目前我国没有建立用于检测转基因大豆DAS81419的国家标准和出入境检验检疫行业标准，这不利于口岸实验室开展非法转基因品系的把关检测。因此，建立转基因大豆DAS81419的检测方法具有相当的意义。

目前，国内外针对转基因大豆的检测方法多采用单重荧光PCR技术，该技术在特异性、灵敏度、重现性等方面具有较大的优势，成为该领域的主要技术之一，但国内针对转基因大豆DAS81419品系的检测鲜有报道，而且目前还没有能同时检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的多重荧光定量PCR技术的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、高效且能同时检测检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测效率高和适用范围广的引物对和探针组合，以及含有该引物对和探针组合的试剂盒及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对和探针组合包括第一组引物对、第二组引物对、第一探针和第二探针，所述第一组引物对包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第一探针与所述第一组引物对相对应，所述第一探针包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述第二组引物对包含SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述第二探针与所述第二组引物对相对应，所述第二探针包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了所述的引物对和探针组合在检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因，或制备检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于对转基因大豆进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括：

荧光定量PCR扩增试剂，所述荧光定量PCR扩增试剂包括dNTPs、Mg²⁺、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶，所述dNTPs、Mg²⁺、PCR反应缓冲液和Taq DNA聚合酶均来源于Takara公司的货号为RR390A的试剂盒中所包含的试剂；

所述试剂盒还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括来自达安基因的货号为DA-Z146的核酸提取试剂、Promega公司的货号为A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的货号为9781的MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit中所包含的试剂；

所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。

需要说明的是，这里所提到的“所述试剂盒还包括DNA提取试剂”指的是，本发明的试剂盒中还包含DNA提取试剂盒中的相应成分或试剂，DNA提取试剂盒可以根据需要独立地存在或者包含在本发明的试剂盒内。

另一方面，本发明提供所述的试剂盒在检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因，或制备检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的产品中的应用。

另一方面，本发明提供一种检测或辅助检测转基因大豆DAS81419和大豆内源基因的双重荧光PCR方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：