[发明专利]一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用；本发明公开的染料检测蛋白浓度范围为0.1‑25 ug/mL，灵敏度高；受测样本不论为纯化蛋白或抗体皆适用，还可应用于含有还原剂、核酸、氨基酸与咪唑的蛋白样品；对盐类、缓冲液、去垢剂或其他化学物质都有良好的耐受性；高度均一性好；灵敏度高；还具有线性关系好、可重复性强、稳定性好、操作简单等优点，解决了现有蛋白定量分析方法中常见的问题。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用。

背景技术

在生物学研究中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要而且不可缺少的工作。在日常科研中，由于蛋白样品的微量性，蛋白定量的结果不仅需要非常精确，而且要求进行蛋白定量的方法具备非常高的灵敏度；除此之外，抗干扰能力、检测试剂稳定、操作简单也是进行蛋白定量分析方法所必须考虑的因素。

蛋白质定量分析的方法有许多种。从技术原理上分，可以分为两大类。科研上常以光度测定（photometric）进行蛋白质定量，通过染料与蛋白相互作用，由已知浓度的蛋白质标准品的吸光值或荧光强度，来测定未知浓度的蛋白质样本。基于吸光值的蛋白定量方法被称之为第一类蛋白定量方法，如BCA法、Bradford法、Lowry法，这类试剂的检测结果存在线性度不佳、灵敏度差、检测时间较长、样品需求量大、抗干扰能力差且测量范围窄等缺点，因此在科研上的应用备受限制；第二类是以荧光染料为核心开发的蛋白定量方法，如Thermo公司旗下Molecular Probes的NanoOrange以及CBQCA，与第一类试剂相比，这类试剂在灵敏度方面得到较大提高。其中，CBQCA试剂本身几乎是无荧光的，但当在氰化物的存在情况下，它与蛋白质的伯胺相互作用形成高荧光性的物质，通过Ex/Em=450/550 nm对其荧光进行检测来计算蛋白质浓度。另外一种NanoOrange试剂在水溶液中也是不会发荧光的，只有与蛋白相互作用后，在Ex/Em=470/570nm处检测到最强荧光，通过荧光计、荧光酶标仪等检测荧光，从而定量蛋白质含量。

CBQCA试剂存在明显弊端，在其与蛋白质反应过程中需要氰化物的帮助，才能形成可检测的荧光物质，并且这种试剂的操作繁琐，仅孵育步骤就需要至少1小时以上。NanoOrange试剂虽然克服了CBQCA的缺点，但是依然存在很多问题，如NanoOrange检测范围狭窄，仅为0.1-10 ug/mL，线性度不佳，整个测量范围内，线性相关系数R²达不到0.99以上（R²越接近1表示线性度越好，只有在小数点之后有两个9以上才被认为线性度好），尤其在指纹区（0-1.25 ug/mL）范围更是达不到蛋白定量要求（在这个测量范围内，线性相关系数R²的值仅在0.92左右，远低于一般认可的0.95），重复性不好、信号稳定时间仅为6小时。

发明内容

本发明的目的是公开一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法；具备灵敏度高，线性关系好、抗干扰性强、稳定性好、操作简单等优点，解决了现有蛋白定量分析方法中常见的问题。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种用于蛋白质定量的荧光染料，具有如下化学结构式：

其中R₁、R₂独立的选自C1～C12的直链烷基；R₃为-OH（羟基）、 C1～C8的直链或者支链烷基、-OCH₃（甲氧基）；n 为3～12。

本发明进一步公开了所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法，包括以下步骤：

（1）以取代苯胺化合物、溴化合物为原料，在碳酸盐存在下，制备得到中间体I；

（2）以中间体I为原料，在三氯氧磷存在下，制备得到中间体II；