[发明专利]一种用于蛋白质定量的荧光染料及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种蛋白质定量分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将用于蛋白质定量的荧光染料用缓冲液稀释得到染料工作液；

（2）将待检测蛋白质溶液与染料工作液混合后避光条件下加热处理；然后室温冷却；再经离心处理收集上清液为测试样本；

（3）将测试样本加入酶标板；然后测试荧光强度；最后将荧光强度带入牛血清白蛋白溶液浓度与荧光强度关系曲线，得出待检测蛋白质浓度，完成蛋白质定量分析；

所述用于蛋白质定量的荧光染料具有如下化学结构式：

其中R₁、R₂独立的选自C1～C12的直链烷基；R₃为-OH、C1～C8的直链或者支链烷基、-OCH₃；n为3～12。

2.根据权利要求1所述蛋白质定量分析的方法，其特征在于，所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法包括以下步骤：

（1）以取代苯胺化合物、溴化合物为原料，在碳酸盐存在下，制备得到中间体I；

（2）以中间体I为原料，在三氯氧磷存在下，制备得到中间体II；

（3）以4-甲基吡啶与环烷基磺酸为原料，制备得到中间体III；

（4）以中间体II与中间体III为原料，在甲醇中反应制备得到用于蛋白质定量的荧光染料；

所述取代苯胺化合物的化学结构式为：

所述溴化合物的化学式为：R₁R₂Br；

所述环烷基磺酸的化学结构式为：

；n为3～12。

3.根据权利要求2所述蛋白质定量分析的方法，其特征在于，所述用于蛋白质定量的荧光染料的制备方法包括以下步骤：

（1）反应瓶中加入取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐以及溶剂，于80～100℃ 反应；反应结束后提纯得到中间体I；

（2）反应瓶中加入溶剂，在氮气保护下，冰水浴条件下滴加三氯氧磷，滴加完成20～40分钟后滴加含有中间体I的1,2-二氯乙烷溶液，调节温度至80～100℃，反应；反应结束后提纯得到中间体II；

（3）反应瓶中加入4-甲基吡啶、环烷基磺酸，于80～100℃搅拌反应；反应结束后提纯得到中间体III；

（4）反应瓶中加入中间体II、 中间体III、六氢哌啶、甲醇，于55～65℃反应；反应结束后提纯得到用于蛋白质定量的荧光染料。

4.根据权利要求3所述蛋白质定量分析的方法，其特征在于：取代苯胺化合物、溴化合物、碳酸盐的摩尔比为1∶2.5∶2.5；三氯氧磷、中间体I的摩尔比为4∶1；4-甲基吡啶、环烷基磺酸的摩尔比为1∶3.6；中间体II、中间体III、六氢哌啶的摩尔比为1.6∶1∶0.05。

5.根据权利要求3所述蛋白质定量分析的方法，其特征在于，每步反应的提纯具体为：

（1）反应结束后，反应液冷却至室温后倒入清水中，然后用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，再用饱和食盐水洗涤；然后用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，收集旋干得到中间体I；

（2）反应结束后，反应液冷却至室温后倒入冰水中，然后用二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷层，再饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干，硅胶过柱纯化，收集旋干得到中间体II；

（3）反应结束后加入乙酸乙酯回流后降至常温，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥后得到中间体III；

（4）反应结束后，反应液旋干后硅胶过柱纯化，收集旋干得到用于蛋白质定量的荧光染料。

6.根据权利要求1所述蛋白质定量分析的方法，其特征在于：牛血清白蛋白溶液浓度与荧光强度关系曲线的制备为，配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液，然后避光条件下加热处理；然后室温冷却；再经离心处理收集上清液为测试样本；将不同浓度的牛血清白蛋白溶液对应的样本分别加入酶标板中，分别测试荧光强度，从而得到荧光强度与牛血清白蛋白溶液浓度的关系曲线。