[发明专利]一种制备CAR‑T细胞的方法以及制得的CAR‑T细胞及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域，具体而言，涉及一种制备CAR-T细胞的方法以及制得的CAR-T细胞及其应用。

背景技术

大部分具有B细胞恶性肿瘤—包括慢性淋巴细胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL)的患者，使用化疗、靶向治疗的治愈率以及预后都很差。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)的表达，靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是被设计为以人白细胞抗原-非依赖性的方式识别细胞表面抗原的抗原受体。利用表达CAR的基因修饰的T细胞治疗这些类型患者的尝试已经得到一定程度的成功(Molecular Therapy,2010,18:4,666-668；Blood,2008,112:2261-2271)。

随着嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为三代。第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single-chain fragment variable,scFV)、跨膜区(transmembrane region,TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et.al.Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways,Cancer Res2007,67(22):11029-11036.]。

随后发展的第二代CAR-T细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T细胞的持续增殖，并能够提高T细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR-T在体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et.al.CD28costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients.J Clin Invest,2011,121(5):1822-1826]。

近些年发展的第三代CAR-T细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR-T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C.,et al.Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137domains.PNAS,2009,106(9):3360-3365.]。

CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，目前，CAR-T细胞临床试验的细胞来源大多数都是取自患者自身的外周血T细胞，这样会导致如下三个十分显著的问题：1)患者的外周血采集后需要10-14天才能完成CAR-T回输，这段时间可能错过病人治疗的最佳时机；2)患者由于进行过多种治疗(例如，放化疗)，会使其T细胞活性过低，无法保证回输CAR-T的量；3)患者可能不适宜采血。这一短板严重制约着CAR-T细胞用于个体化治疗的应用和市场推广。另外，在同种异体的环境中，使用供体来源的CAR-T细胞会在患者体内引起免疫排斥反应。

综上可知，本领域迫切需要建立一种克服上述缺陷的制备CAR-T细胞的方法。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种制备CAR-T细胞的方法，该方法简单易行，易于工业化生产。