[发明专利]一种纽莫康定B0的提取、纯化方法

说明书

本发明公开了一种纽莫康定B0的提取、纯化方法，包括：1)将含有纽莫康定B0的发酵液调整pH值，加入助滤剂，过滤得到菌渣；2)菌渣用高浓度甲醇水溶液或乙醇的水溶液浸提；3)用吸附树脂树脂吸附浸提液，用甲醇(乙醇)80‑90％(V/V)‑水溶液洗脱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液；4)在纽莫康定B0的洗脱液中加入活性炭进行脱色处理；5)用吸附树脂吸附，80‑100％(v/v)甲醇(乙醇)‑水溶液洗脱树脂，收集富含纽莫康定B0的洗脱液；6)真空浓缩至得到纽莫康定B0粗品。通过提取纯化方法的改进，脱色除杂效果明显，产物纯度明显提高，生产成本低，工艺步骤简单、适合工业化生产。

技术领域

本发明属生物制药领域，具体涉及一种纽莫康定B0的提取纯化方法。

背景技术

卡泊芬净是全球第一个上市的棘白霉素，其作用机制独特，以真菌细胞壁为靶位，特异性抑制细胞壁β(1，3)-D-葡聚糖的合成，破坏真菌细胞壁的完整性，使真菌细胞内渗透压不稳定，最终导致真菌细胞溶解。而哺乳动物细胞中不含—β-(1，3)-葡聚糖，无类似的细胞壁合成过程，因此，卡泊芬净抗真菌的同时，不会破坏和影响人体细胞。体外药理学研究显示，卡泊芬净对多种念珠菌、地方性真菌、曲霉及卡氏肺囊虫均有效，因而越来越受到人们的关注。

纽莫康定B0(Pneumocandin B0)是由真菌Zalerion arB0ricola产生的次级代谢产物，是合成抗真菌药物卡泊芬净(CasPofungin)的中间体。

作为合成抗真菌药物卡泊芬净(CasPofungin)的中间体，纽莫康定B0由真菌发酵产生，发酵过程中会产生与纽莫康定B0结构相近似的副产物及大量的色素，因此纽莫康定B0的提取纯化方法较复杂。按照结构中脯氨酸上取代基的不同主要分为三大类：A0(32羟基242甲基脯氨酸)、B0(32羟基脯氨酸)和C0(42羟基脯氨酸)，此外，根据环状多肤上取代基的不同纽莫康定A0又可以分为AO、Al、AZ、A3、A4五小类，B0又可以分为B0、B2两小类。

在Pneumocandins From Zalerion arboricola I.Discovery And Isolation(The Journal Of Antibiotics 45(12):1853-1866)一文中，描述了纽莫康定B0的提取、纯化方法。其方法简介如下：

1)调节发酵液pH，高速离心后取菌丝体，用两倍体积的甲醇浸泡，离心后，再次用80％的甲醇浸泡以提取纽莫康定B0并合并甲醇浸提液；

2)加水稀释甲醇提取液后，用40％-50％的甲醇上HP-207树脂柱，先用65:35的甲醇水洗柱子，再用100％的甲醇将纽莫康定B0洗脱下来；

3)在25度时，纽莫康定B0溶液中缓慢加入醋酸异丙酯沉淀，再通过过滤和离心蒸干后得到纽莫康定B0纯度约为67％，收率约为84％；

4)用硅胶层析和HP20树脂吸附进行再次纯化，用85:10:5的EtOAC-MEOH-5％AcOH洗柱子，收集后在用50％的甲醇水溶解上HP20，先用50％洗，再用100％的甲醇水冲洗，50％的回收再用；

5)加已腈沉淀纽莫康定B0，再过滤，最终纯度为85％。

6)在正丙醇中，50mg/ml浓度，60度加热，加水后冷却到室温结晶。此工艺的主要缺点是分离步骤烦琐，且上游发酵液中的色素很难彻底除去，最大的缺点是硅胶层析中的硅胶很不稳定，很难进行大生产。

美国专利Purification Process(US6610822)也提供了纽莫康定B0的提取、纯化方法，也就是反复采用萃取和反萃取法，反复萃取和洗涤，这一方法要使用大量的异丁醇、甲醇和庚烷等有机溶媒，操作较复杂，最终沉淀得到的纽莫康定B0固体，纯度只有80％左右。不仅纯度不高，色素杂质去除很不完全。根本就不适合大生产。