[发明专利]一种铁皮石斛干药材分子鉴定方法及其应用

说明书

本发明公开了一种名贵中药铁皮石斛干药材分子鉴定方法及其应用，可有效解决铁皮石斛干药材快速鉴定问题。具体步骤如下：(1)以改良的DNA提取方法制备待测样品DNA模板；(2)通过特异的PCR扩增引物和反应参数，扩增样品rDNA ITS2片段；(3)对扩增产物进行测序，获得铁皮石斛干药材的ITS2序列；(4)构建样品的ITS2序列NJ树。本发明能够实现铁皮石斛干药材、基原植物、种子种苗等的快速、准确鉴定。

技术领域

本发明涉及术语中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA ITS2片段快速鉴别铁皮石斛干药材的方法及其应用。

背景技术

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(《中国植物志》英文版eflora中拉丁名为Dendrobium catenatum Lindley)为兰科珍稀名贵药用植物，有“中华九大仙草之首”之盛名。铁皮石斛对生长环境条件要求苛刻，其自然繁殖能力低，生长缓慢，又经长期采挖，自然资源濒临枯竭，被列为国家重点保护的药材品种。2010年版《中国药典》中关于铁皮石斛的描述为“本品为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎。11月至翌年3月采收，除去杂质，剪去部分须根，边加热边扭成螺旋形或弹簧状，烘干；或截切成段，干燥或低温烘焙，前者习称铁皮枫斗(耳环石斛)；后者习称铁皮石斛。”目前，我国药用石斛约有50余种，然而市场上把石斛属其他植物或兰科某些植物也作为铁皮枫斗混入商品流通和临床应用，对铁皮石斛的临床疗效和用药安全产生了很多不良影响。中药材DNA条形码分子鉴定技术依赖样品自身的基因分子信息，能够实现物种的准确鉴定。目前该技术在铁皮石斛干药材的鉴定中有以下问题：(1)铁皮枫斗加工过程中，多有80℃～100℃的加热过程，且时间较长，会造成样品DNA的严重降解，影响DNA的提取效率；(2)铁皮石斛多糖含量高，严重影响DNA的提取纯化；(3)通用引物ITS2F/3R在铁皮石斛干药材ITS2序列扩增中，扩增成功率低。针对以上问题，急需寻找一种稳定、可靠的方法用于快速鉴定名贵中药铁皮石斛干药材。

发明内容

本发明第一个目的是提供铁皮石斛干药材rDNA ITS2序列的获取方法。

本发明第二个目的是提供利用rDNA ITS2序列鉴别铁皮石斛干药材的方法。

本发明提供的铁皮石斛干药材DNA快速提取技术，针对多糖含量高、加工过程造成DNA严重降解的特点，采取以下改进：取铁皮石斛干燥药材20-30mg，切碎后使用MM400球磨仪粉碎，加入核分离液500-1000μL，充分混匀，7000r/min离心5min，弃上清，加入核分离液500-1000μL，重复此步骤3-5遍至上清不粘稠。其余步骤参照植物基因组DNA提取试剂盒标准操作方法进行。核分离液的配比为：Tris-HCl(pH8.0)终浓度100mmol·L^-1，EDTA(pH8.0)终浓度20mmol·L^-1，NaCl终浓度0.7mol·L^-1，2％PVP-40(W/V)，以上各物质配成溶液后灭菌，使用之前加入β-巯基乙醇0.4％(V/V)。

本发明提供的铁皮石斛药材核糖体DNA ITS2片段制备方法主要包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA。

(2)PCR扩增ITS2序列，按25μL扩增体系进行：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正反向特异引物DO-F和DO-R各1.0μL(2.5μmol·L^-1)，DNA模板溶液10.5μL。

(3)用于扩增ITS2序列的引物为：

正向DO-F：5’-GGCGTCAAGCATTTTATCTCTCC-3’；

反向DO-R：5’-AATCCTCGTAAGTTTCTTTTCCTCC-3’。