[发明专利]一种快速检测异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭源性成分的方法

说明书

技术领域：

本发明属食品检验技术领域，尤其涉及一种实时荧光PCR检测用引物和探针以及利用该引物和探针对异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭源性成分进行鉴别检测的方法。

背景技术

目前，国内用于检测动物源性成分的技术主要有二种：酶联免疫吸附实验(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)，在实际检测中应用最多的是PCR法。PCR法可分为普通定性PCR和实时荧光PCR。实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术基础上发展而来的，其中，TaqMAN探针法实时荧光PCR是在扩增反应体系中添加一个特异性的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，即检测靶核苷酸序列扩增状态，以进行结果判定。它的主要优点是：(1)在闭管状态下进行扩增产物检测，无需PCR产物的后处理，避免了扩增产物污染而致的假阳性，保证了结果的可靠性；(2)探针杂交特异性更强，灵敏性更高，在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，荧光信号由仪器自动收集，进一步提高了灵敏度；(3)无需酶切位点存在，无需进行酶切，电泳，节省了时间，PCR后无需后续处理，操作更简单快速。

鳕鱼肉味甘美、营养丰富。肉中蛋白质比三文鱼、鲳鱼、鲥鱼、带鱼都高，而肉中所含脂肪和鲨鱼一般只有0.5％，要比三文鱼低17倍，比带鱼低7倍；肝脏含油量高，除了富含普通鱼油所有的DHA、DPA外，还含有人体所必需的维生素A、D、E和其他多种维生素。鳕鱼肝油中这些营养成分的比例，正是人体每日所需要量的最佳比例。因此，北欧人将它称为餐桌上的“营养师”。

一般来说，鳕属里的三种鱼：大西洋鳕鱼(Gadus morhua)，格陵兰鳕鱼(Gadus ogac)和太平洋鳕鱼(Gadus macrocephalus)才称得上传统意义上纯正的鳕鱼。

但是市场上常有人用外表形态与鳕鱼相似的“油鱼”-蛇鲭鱼混杂在鳕鱼中，或直接以鳕鱼之名售卖。蛇鲭鱼包括两种鱼，异鳞蛇鲭(Lepidocybium flavobrunneum)和棘鳞蛇鲭(Ruvettus pretiosus)，它们体内肌肉和骨骼含有近20％的油脂，其中又以一种被称作蜡酯的物质为多。这些蜡酯来自于蛇鲭的食物，同时对于维持它们的身体机能有很重要的作用。但是，人却不能消化这种物质，如果一次摄入过多的话，就会引起腹痛、腹泻、恶心和呕吐等不良反应。

目前，还没有快速鉴定异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭源性成分的方法，只能通过DNA条码识别系统来鉴别，而DNA条码识别技术涉及普通定性PCR、电泳、PCR产物回收和纯化、测序、序列比对分析等程序，步骤繁琐、周期较长。综上所述，本领域迫切需要开发新的快速简便地检测异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭源性成分的技术。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种实时荧光PCR检测异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭源性成分的引物和探针及方法。

实时荧光PCR检测异鳞蛇鲭源性成分的引物和探针，分别为：

上游引物P1：TCCCTCGAATGAATAACATA

下游引物P2：CTCCTGAAGAGGCTAATAG

带有荧光染料的探针序列为：TGACTTCTGCCTCCATCCTTCC

所述的荧光染料，5‘端为FAM标记，3’端为TAMRA标记。

实时荧光PCR检测棘鳞蛇鲭源性成分的引物和探针，分别为：

上游引物P1：CTCCTCCTATTATCCCTG

下游引物P2：CGAAGAAGGTTGTGTTTA

带有荧光染料的探针序列为：TTACAATGCTCCTCACAGACCGAA

所述的荧光染料，5‘端为VIC标记，3’端为TAMRA标记。

实时荧光PCR检测蛇鲭鱼源性成分的方法，其步骤如下：

1、提取待检样品基因组DNA

2、将检测异鳞蛇鲭和棘鳞蛇鲭的上游引物、下游引物和探针稀释至10μmol/L，然后等体积合并为混合引物(探针)，以所提取的DNA作为模板，加入上述引物对和荧光染料标记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应，记录样品反应的Ct值；

所述的实时荧光PCR反应体系为：

3、所述的实时荧光PCR反应条件为95℃10min，1个循环；95℃，15s，58℃30s，40个循环，在每次循环的58℃/30s时收集荧光，设立FAM和VIC通道。

所述的实时荧光PCR方法还设有空白对照、阴性对照、阳性对照，判定标准为：