[发明专利]一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物免疫领域，更具体地说涉及一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法。

背景技术：

家蚕是世界上饲养最多的昆虫，利用家蚕幼虫栽培北虫草有着丰富的可利用资源。再者，近几年蚕桑业也面临着严重的滑坡，如何提升蚕桑产业的附加值迫在眉睫，利用家蚕幼虫栽培北虫草不仅成本较低，而且营养价值也不低于野生的冬虫夏草，社会与经济效益显著，就一张蚕种的产值来算一笔经济账，一般春蚕饲养1张蚕种，张种产量100斤左右，茧价2000元/担，一张种收入2000元，用一张五龄幼虫蚕种栽培北虫草，可得到干体蚕虫草14斤左右，以每斤500元计算，一张种的产值7000元，是丝茧育的3.5倍，可大大的提升蚕桑产业的产出值。

发明内容：

本发明的目的就是针对现有技术的不足，而提供一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法。本发明具有步骤简单，使用方便，可以推测北虫草多糖能有效提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应，北虫草多糖对Th1和Th2类细胞因子均有明显的提升效果，表明机体的免疫应答机制可能被激活，另外，北虫草多糖可能对体液免疫和细胞免疫反应的平衡上具有一定的调节作用的优点。

本发明的技术解决措施如下：

一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本发明包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、I gG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。

上述技术方案中，所述北虫草多糖粗提物制备的步骤包括：将北虫草3000g,粉碎,用石油醚脱脂3次,每次10.5L,共去掉脂质601.5g；残渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，减压浓缩至1.25g/ml。

上述技术方案中，所述实验动物及其免疫的步骤包括：将ICR小鼠35只随机分成7组,每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA(10μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理盐水溶液,对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液，2周后进行二免,二免后3周采血,制备血清。

上述技术方案中，所述I gG效价的测定的步骤包括：在96孔酶标板每孔加入100μL包被液(含5μg OVA/mL的0.05mol/L碳酸盐缓冲液),置4℃孵育18h后,洗涤液(pH 7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS 封闭液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释,使血清稀释度为1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB(四甲基联苯二胺)底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。

上述技术方案中，所述IgG亚类测定的步骤包括：在已包被抗原OVA的96孔酶标板上加入1:800倍稀释的待检血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:600稀释的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入1:4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。