[发明专利]一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法

权利要求书

1.一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，本发明包括如下步骤：(1)北虫草多糖粗提物制备；(2)、实验动物及其免疫；(3)、IgG效价的测定；(4)、IgG亚类测定；(5)、淋巴细胞转化试验；(6)、细胞因子mRNA检测；(7)统计学分析，得出结论。

2.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述北虫草多糖粗提物制备的步骤包括：将北虫草3000g,粉碎,用石油醚脱脂3次,每次10.5L,共去掉脂质601.5g；残渣用70％乙醇60℃回流提取5次,每次12L,合并提取液，减压浓缩至1.25g/ml。

3.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述实验动物及其免疫的步骤包括：将ICR小鼠35只随机分成7组,每组5只。每只小鼠颈部皮下注射含OVA(10μg)和组分A、B、C、D、E或者ECMS(50μg)的生理盐水溶液,对照组小鼠注射含OVA的生理盐水溶液，2周后进行二免,二免后3周采血,制备血清。

4.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述IgG效价的测定的步骤包括：在96孔酶标板每孔加入100μL包被液(含5μgOVA/mL的0.05mol/L碳酸盐缓冲液),置4℃孵育18h后,洗涤液(pH 7.4磷酸盐缓冲液PBS)洗涤3次,每次3min；每孔加入300μL含1％小牛血清的PBS封闭液(0.01mol/L,pH 7.4),于37℃孵育1h后,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；用稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释,使血清稀释度为1∶50～1:3200；于37℃孵育2h后,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:500稀释的羊抗小鼠IgG抗体(CHEM I CON Internati onal I nc),100μL/孔,37℃孵育2h,再用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB(四甲基联苯二胺)底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。

5.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述IgG亚类测定的步骤包括：在已包被抗原OVA的96孔酶标板上加入1:800倍稀释的待检血清(100μL/孔)，37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入经1:600稀释的生物素标记的山羊抗小鼠IgG1或IgG2a,100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入1:4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素100μL/孔,37℃孵育1h,用洗涤液洗涤3次,每次3min；加入TMB底物溶液显色,100μL/孔,37℃孵育15min,加1mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应；用酶标仪在450nm波长测定OD值。

6.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述淋巴细胞转化试验的步骤包括：将小鼠脱颈椎处死，75％酒精液浸泡5-10min，无菌操作取小鼠脾脏，加入1mL Hank’s研磨，研磨均匀后将脾细胞吹悬入平皿，过200目铜网后转移入10mL离心管；1500rpm离心10min；PBS洗涤2次；细胞计数后，调整细胞浓度至2.5×10⁶/mL，按100μl/孔的量加入96孔细胞培养板中；用细胞培养液配制各种刺激物，向各孔中加入刺激物(LPS终浓度为5μg/mL，ConA终浓度为7.5μg/mL，设阴性对照和空白对照)；37℃、5％CO₂培养箱中培养48h；在培养结束前4h，每孔加入50μl MTT(2mg/mL)；然后将培养板取出，离心(1 500rpm，10min)沉淀细胞，轻轻倾去培养液上清，纸巾吸干；每孔加入150μl二甲基亚砜，避光充分振荡，直至蓝色颗粒完全溶解，570nm波长酶标仪检测OD值；计算淋巴细胞刺激指数(Stimulation index，SI)：

SI＝(刺激孔OD－空白孔OD)/(未刺激孔OD－空白孔OD)。

7.根据权利要求1所述的一种研究北虫草多糖对机体的体液免疫应答和细胞免疫应答反应的方法，其特征在于：所述细胞因子mRNA检测的步骤包括：

(a)、脾淋巴细胞体外刺激；

(b)、Total RNA提取；

(c)、反转录；

(d)、引物及探针设计；

(e)、Real-time PCR反应体系及条件；

(f)、相对定量计算方法。