[发明专利]遗传性乳腺癌与卵巢癌BRCA1/2基因热点突变位点检测试剂盒

权利要求书

1.一种遗传性乳腺癌与卵巢癌BRCA1/2基因热点突变位点检测试剂盒，其特

征在于，包括以下成分:BRCA1/2基因热点位点外显子区PCR扩增与测序引物14

对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；

所述引物序列为：

2.如权利要求1所述的遗传性乳腺癌与卵巢癌BRCA1/2基因热点突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述引物序列扩增出的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的遗传性乳腺癌与卵巢癌BRCA1/2基因热点突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂选自dNTP或Taq DNA聚合酶；所述的PCR产物纯化试剂选自SAP酶或ExoI酶；所述的DNA测序试剂选自BigDye mix、EDTA溶液、乙醇溶液或HI-DI溶液。

4.如权利要求1所述的遗传性乳腺癌与卵巢癌BRCA1/2基因热点突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的通过下述方法检测遗传性乳腺癌与卵巢癌BRCA1/2基因热点突变位点：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)BRCA1/2基因PCR扩增；

所述步骤(2)BRCA1/2基因PCR扩增，采用权利要求1所述引物序列；每个PCR扩增体系总体积为16μL，包含Taq酶混合液7.5μL、去离子水5.5μL、引物对1μL、基因组DNA 1ul；PCR反应条件为95℃15分钟，进行14个循环的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟；

(3)PCR产物纯化

每个反应体系总体积为5.6μL，包括PCR产物4μL和1.6μL SAP酶混合物，反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟；

(4)DNA测序反应

每个反应的体系为总体积10u1，包括PCR酶解产物1μL、BigDye mix 2.2μL和测序引物0.5μL，余量为去离子水；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；

反应结束后每管内加入2.5μL EDTA，30μL100％乙醇，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL 70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；使酒精在室温挥发净，加入8μL Hi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟，放入测序仪中测序。

5.如权利要求4所述的遗传性乳腺癌与卵巢癌BRCA1/2基因热点突变位点检测试剂盒，其特征在于，将测定的各样本序列与GenBank数据库BRCA1基因序列(NM_007294.3)和BRCA2基因序列(NM_000059.3)进行比较，所述BRCA1基因序列如SEQ N0.1所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述BRCA2基因序列如SEQ N0.3所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示；检测结果包括：

1)未检出突变：表明未发现BRCA1/2基因存在突变；2)检出突变：表明发现BRCA1/2基因第7号外显子上存在突变。