[发明专利]一种巨噬细胞培养基及培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种巨噬细胞培养基及培养方法。

背景技术

巨噬细胞是三大抗原提呈细胞之一，是参与非特异和特异性免疫的重要细 胞。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行 噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作 出反应。由于巨噬细胞具有较强的吞噬功能以及抗原提呈功能，所以在免疫学 上具有较大的研究价值。

由于培养条件的限制，要获得大量的巨噬细胞非常困难，更是缺少大规模 培养巨噬细胞的方法，限制了巨噬细胞的应用。现有技术中培养巨噬细胞的方 法如下：分离外周血中的单个核细胞(PBMC)，将PBMC使用含有30ng/mL GM-CSF(粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子)、10％FBS(胎牛血清)的RPMI1640 培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，使用的培养器皿为T25、T75或者T175 的培养瓶，培养7天后收获贴壁细胞，即为巨噬细胞。该现有技术方案对巨噬 细胞培养扩增有限，并且是针对小规模培养的方法，不适合大规模培养的需求， 在细胞需求量增大时，操作繁琐，耗费大量人力和时间。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种巨噬细胞培养基及培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种巨噬细胞培养基，含有DMEM培养基、FBS、GM-CSF、脂多糖和白 介素-14(IL-14)。

优选地，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：

进一步优选地，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：

进一步优选地，所述巨噬细胞培养基含有下述含量的下述组分：

一种巨噬细胞的培养方法，使用本发明巨噬细胞培养基、微载体和摇袋式 细胞培养生物反应器培养巨噬细胞。

优选地，所述巨噬细胞的培养方法，包含以下步骤：

S1、用本发明巨噬细胞培养基重悬PBMC，使PBMC密度为0.5×10⁶-2× 10⁶cells/mL，再将其接种于培养瓶，每3-4天换液一次；培养7天后弃去上清， 加入胰酶-EDTA消化液消化至细胞完全脱落，加入3倍体积的FBS终止消化， 离心去除上清液；

S2、用本发明巨噬细胞培养基重悬细胞，调整细胞密度至5×10⁴cells/mL， 取4×10⁷个细胞与4g微载体混合，将混合液加入摇袋式细胞培养生物反应器中 在37℃、5％CO₂条件下培养；20转/分钟培养3小时，50转/分钟培养至第3天， 70转/分钟培养至第6天，每3天向反应器中添加100mL培养基；

S3、倒出反应器中的培养基，离心去除上清，PBS清洗2遍后用胰酶-EDTA 消化液消化5分钟，加入3倍体积的FBS终止消化，离心去除上清，用PBS重 悬沉淀，过滤收集滤液即得巨噬细胞。

优选地，所述摇袋式细胞培养生物反应器为25型GEwave摇袋式细胞培养 生物反应器。

优选地，所述微载体为Cytodex-1微球载体。

优选地，所述微载体在使用前进行预处理，预处理的方法为将Cytodex-1微 球载体用DMEM培养基浸泡过夜。

优选地，所述胰酶-EDTA消化液中EDTA的质量浓度百分数为0.02％，胰 酶的质量浓度百分数为0.25％。

现有的细胞培养方法是使用培养瓶培养，每个培养瓶培养出来的最大细胞 数为1×10⁷个，因此如果要获得1×10⁹个细胞，需要大量人力物力和时间，且 巨噬细胞难被从培养瓶上消化下来，操作时间长，操作时污染风险大。与现有 技术相比，本发明是一种大规模培养巨噬细胞的方法，可以获得10⁹个以上细胞。 本发明操作简便，只需要操作一台仪器和一个培养袋，单人就可以操作，可有 效的缩短培养时间和操作时间，减少人力物力的浪费。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本发明中 所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在 此不再赘述。