[发明专利]抗草甘膦基因筛选方法、EPSPS突变基因和缺陷型菌株及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及抗草甘膦基因筛选方法、EPSPS突变基因和缺陷型菌株及应用。

背景技术

Glyphosate是由美国孟山都公司研发，是一种叶面喷施，广效，非选择性的系统性草甘膦。其主要成分草甘膦发挥作用的途径是抑制植物体内莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)活性，使受害植株不能持续合成必需氨基酸进而影响植物正常生长乃至死亡。

Glyphosate是一种广谱的草甘膦除草剂，对几乎所有植物都有杀伤性，现市场上最常用的抗草甘膦基因为CP4基因，是孟山都公司从农杆菌中分离出的对草甘膦强抗性的基因。植物可以通过转基因的方式获得这种抗性。因为能抗草甘膦的农作物为农业和环境带来明显效益，含CP4基因的玉米、大豆品种在过去20年得到了大面积推广。但生产应用中仍然不断需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的抗草甘膦作物品种。

用基因编辑技术创造非转基因抗草甘膦植物最好要有能抗草甘膦的植物EPSPS基因。以CP4为代表的的微生物EPSPS基因虽能提供草甘膦抗性，即使将这类基因用基因修饰的方法转入植物，但因为来自不同物种，仍有转基因之嫌，难以得到社会普通大众的认同，公众对这里转基因作物的认识有偏见，某种程度阻碍转基因技术的发展和普及。因此，打造能高抗草甘膦的植物EPSPS基因是非转基因抗草甘膦农作物的一个关键。

从理论上讲，植物本身的EPSPS基因可以用化学、辐射或其他方法进行诱变，在一定的草甘膦压力下筛选具有抗性的植株。事实上，在多年大量使用草甘膦的情况下，一些杂草已经进化了对草甘膦的抗性；其中多数为EPSPS基因的改变。但这些改变多为基因拷贝数的增加，而且抗性不是很高，难于用在农作物上。农作物本身EPSPS基因也有突变产生草甘膦抗性的例子，但抗性不如CP4。为创造能高抗草甘膦的非转基因农作物，继续诱变、筛选农作物或其他植物EPSPS基因抗性基因势在必行。

但是，现有的从农作物或其他植物中筛选具有草甘膦抗性的突变基因的方法需要先对植株进行诱变处理得到大量的突变体植物，再对这些突变体植株进行抗性筛选，得到具有草甘膦抗性的突变植株，通过对抗性植株的基因组检测分析，最后得到具有草甘膦抗性的突变基因。由于植物生长的周期长，种植大量的突变体植株不仅耗费的时间长且需要的土地面积也非常庞大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有草甘膦抗性的突变基因的筛选方法，此筛选方法能够快速地筛选得到来自植物的外源基因的突变基因，该筛选方法筛选得到的突变基因具有草甘膦抗性。

本发明的再一目在于提供一种突变基因，该突变基因由上述筛选方法筛选得到，其具有草甘膦抗性。

本发明的又一目在于提供上述突变基因的应用，以使得转化该突变基因的植物具有草甘膦抗性。

本发明的又一目在于提供一种用于筛选具有草甘膦抗性的突变基因的模型菌，此模型菌不能表达EPSPS，也不具有裂解草甘膦的功能。

本发明的又一目在于提供上述模型菌在测试植物来源的EPSPS基因的功能中的应用。

本发明的又一目在于提供上述模型菌在测试植物来源的EPSPS基因对草甘膦的抗性中的应用。

本发明的又一目在于提供上述模型菌在测试植物来源的突变体EPSPS基因对草甘膦抗性中的应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种抗草甘膦基因筛选方法，其包括：

采用基因敲除技术敲除源菌株的干扰基因，得到缺陷型菌株，源菌株来自大肠杆菌DH5α、TOP10以及BL21中的一种，干扰基因包括功能不同的EPSPS基因和C-P Lyase基因，缺陷型菌株为EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株；

先将外源EPSPS基因导入缺陷型菌株中，再经诱变处理后，得到含有外源EPSPS突变基因的第一突变菌，外源EPSPS基因来自目的植物；

或者先将外源EPSPS基因经突变处理，得到外源EPSPS突变基因，再将外源EPSPS突变基因导入缺陷型菌株，得到第二突变菌；

将第一突变菌或第二突变菌置于含有草甘膦的筛选培养基上进行筛选培养，得到具有草甘膦抗性的单克隆抗性菌；

对单克隆抗性菌进行测序验证，得到具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因。