[发明专利]一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法

权利要求书

1.一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：

（1）黄花油点草的消毒

4月至8月之间，剪取带腋芽的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2 min，倾倒洗洁精溶液后用流水冲洗0.5 h后，在紫外灯消毒30 min以上的超净工作台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，浸泡入滴加有2滴吐温-80的0.1% HgCl₂溶液内浸泡消毒12-13 min，然后用无菌水充分浸洗3次；

（2）腋芽的诱导

将上一步得到的的外植体，以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.2 g/L，6-BA 2.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m²·s)，光源为白色节能灯；

（3）丛生芽的诱导

待上一步培养的腋芽长出后，在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0.5 mg/L，6-BA 1.0-2.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)，光源为白色节能灯；

（4）不定芽的增殖

将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，以正常的极性方向接种到装有添加6-BA 2.0mg/L，IAA 0.5-1.0 mg/L的MS基本培养基的培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)，光源为白色节能灯；

（5）再生植株的生根培养

切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0.2 mg/L，AC 0.5 mg的25% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为15-20 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m²·s)；

（6）炼苗移栽

待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：2的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，炼好苗后，小心挖出移栽入大田。