[发明专利]制备具有高效肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法及制得的DC-CIK免疫细胞

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备DC-CIK免疫细胞的方法，尤其是一种制备具有高效 肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法及制得的DC-CIK免疫细胞。

背景技术

DC-CIK联合免疫细胞，全称是细胞因子激活的杀伤细胞-树突状细胞混 合疗法。它是既含有杀伤性免疫细胞同时还有树突状细胞。树突状细胞因为 长得像树杈得名，是免疫系统很重要的一部分。树突细胞并不直接杀死细胞， 它只是一种免疫呈递细胞，把信号呈递给杀伤免疫细胞，理论上DC-CIK联 合免疫细胞杀死癌症细胞的能力应该更强，但是临床上DC-CIK疗法效果也 是很有限，因为它无法突破DC-CIK疗法的瓶颈：癌症的免疫抑制。

发明内容

本发明所要解决的问题是，提供一种通过阻断PD-1肿瘤免疫抑制通路 来提高DC-CIK免疫细胞的肿瘤杀伤活性的方法制得的DC-CIK免疫细胞。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种制备具有高效 肿瘤杀伤性DC-CIK免疫细胞的方法，以外周血为原材料，通过Ficoll密度 梯度离心法分离获得PBMC和上层血浆，上层血浆采用灭活并冻融的方法获 得自体血清，自体血清配合免疫细胞培养基及多种细胞因子，将分离的PBMC 分别诱导DC、CIK，CIK细胞每隔2天扩大培养、DC细胞在第4天扩大培养， 然后在第7天进行混合培养，DC细胞在第5天用TNF-α进行刺激以促进其 分化成熟，然后加入Anti-PDL-1MAb对DC细胞进行封闭并在封闭12-24h后 将全部DC细胞回收加入到CIK细胞诱导体系中共培养；CIK细胞在第7天 加入CD28、CD3单抗提高CIK的扩增效率，在诱导培养的第13-15天使用 Anti-PD-1MAb对CIK细胞的PD-1抗原进行封闭，并在封闭12-24h后回收 全部细胞。

具体地，包括以下步骤：

1)采集人体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法分离获得PBMC和 上层血浆，上层血浆通过灭活、冻融、高速离心、过滤从中制备出自体血清；

2)配置细胞诱导培养基备用

DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含有体积分数5-15％的步骤1) 中制备的自体血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF；

CIK细胞诱导培养基：免疫细胞培养基中含有体积分数5-15％的步骤1) 中制备的自体血清和300-1000IU/ml的IL-2；

3)分离获得的PBMC取(5-10)*10⁷个细胞接种至T-175细胞培养瓶中， 分别加入40-50ml免疫细胞培养基，并加入步骤1)中制备的2-4ml的自体 血清，孵育1-2h后将未贴壁的细胞及培养上清吸出，贴壁的细胞中加入 40-50mlDC细胞诱导培养基，诱导DC细胞；

4)将步骤3)中的未贴壁的细胞加入到未使用的PBMC中，将所有细胞 加入到提前4-12小时预包被4-10ug的CD3McAb的T-175细胞培养瓶；在培 养瓶中加入50-100mlCIK细胞诱导培养基，并按照终浓度500-1000IU/ml 加入IFN-r，诱导CIK细胞；

5)培养第3天在CIK细胞诱导体系中按照体积分数5-10％加入自体血 清，并按照终浓度300-1000IU/ml补加IL-2继续培养；

6)培养第4天在DC细胞诱导体系中加入30-40mlDC细胞诱导培养基， 混合均匀后培养；

7)培养第5天在CIK细胞诱导体系中加入100-150mlCIK细胞诱导培养 基，混合均匀后继续培养；

8)培养第5天在DC细胞诱导体系中按照终浓度500-1000IU/ml加入 TNF-a进行刺激，12-48小时之后在DC细胞诱导体系中加入2-20ug的 Anti-PDL-1MAb孵育12-24小时之后回收全部DC细胞加入到CIK细胞诱导 体系中，并将全部细胞加入到一个1.8升容量的细胞培养袋中，加入 200-300mlCIK细胞诱导培养基并加入4-10ug的CD3McAb以及15-30ug的 CD28McAb；

9)第9天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入300-400mlCIK细胞诱 导培养基，混合均匀后继续培养；

10)第11天在DC+CIK细胞共培养的培养袋中加入600-800mlCIK细胞 诱导培养基，混合均匀后继续培养；