[发明专利]基因倒位突变检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域的一种基因倒位突变检测方法。

背景技术

染色体的断裂及断裂后染色体断端的异常重接是引起染色体结构畸变的遗传学基础，而倒位(Inversion)是常见的一种染色体结构畸变类型。倒位指染色体上某一区段连发生两次断裂，中间的片段发生180度的倒转，然后重接。很多染色体倒位并没有改变基因的数目，也没有对断点附近的基因造成影响，因此，该类突变的携带者拥有正常的表型，但较大区域的倒位突变可能会在减数分裂中影响同源染色体的配对从而造成杂合子个体生育能力下降。但有些倒位突变的断点位于功能基因内部或调控区附近，会影响改基因的正常表达从而引起疾病(如F8基因22号及1号内含子倒位突变)。

对染色体倒位的快速而准确的检测将有助于医学和遗传学相关领域的科学研究和疾病诊断。现有的具体检测方法可以分为两大类，一类是全基因组水平上的染色体倒位突变检测，另一类是对目标区域进行倒位突变检测。前者主要为细胞核型分析，该技术是检测染色体病最常见的方法，即将待测的细胞的染色体按照该其固有的染色体形态特征和规定，进行配对、编号和分组，并进行形态分析的过程，该技术在染色体疾病诊断中占据重要地位。但其存在分辨率较低，操作复杂，需要专业人员判读检测结果，需要活细胞培养等不足之处，限制了该技术在临床染色体倒位检测中的应用。而后者主要针对特定目标区段的检测，包括Southern印迹杂交(Southern blot)技术(Lakich D et al.,1993)、荧光原位杂交技术(Fluorescent in situ hybridization，FISH)(Sheen CR et al.,2011)、倒位突变等位基因特异PCR(Liu Q et a.l,1997)以及反向PCR技术(inverse-PCR)(Rossetti et al.,2005)。

Southern印迹法的基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。由于染色体倒位会导致基因序列发生变化，使用特定的限制性内切酶如BclⅠ等对发生倒位的基因组进行酶切时，产生的酶切片段大小会与正常基因组酶切后片段大小不一致，并可通过Southern印迹法检测出来。Southern印迹法的应用非常广泛，并被最早使用于血友病F8基因的倒位检测中，是该疾病检测倒位的金标准，具有高度特异性及灵敏性。其缺点在于操作复杂，耗时约一周。之前采用放射性标记物，其灵敏度极高，但是存在着放射性污染及放射核素发生衰变所产生的不稳定性两大缺点。目前多采用地高辛代替放射性标记物，以避免污染。

荧光原位杂交技术(FISH，fluorescence in situ hybridization)是一种重要的非放射性原位杂交技术，也可用于染色体的倒位检测。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。以F8基因第22号内含子倒位为例，根据同源重组区域位置需要设计三种BAC克隆探针，RP11-54I20(insert size179.3kb)，RP11-296N8(178.7kb)，RP11-405N23(164kb)，其中RP11-54I20探针可与倒位区域上游1.25Mb区域杂交，而RP11-296N8与RP11-405N23则可与倒位发生区域杂交，且为区别信号这两个探针杂交位置相差150kb，三种探针标记为不同的荧光信号，分别为蓝(B)、红(R)、绿(G)，杂交后通过检测荧光信号就能知道是否有倒位发生。若为野生型则荧光信号为BRG，若为倒位则为BGR，携带者则这两种组合的信号都会出现BGR/BRG。荧光原位杂交技术检测的结果判读直观快速，具有较高的敏感性与特异性，但也存在一些不足。FISH探针的制备比较耗时与昂贵；对实验操作的技术性要求比较高；由于染色体形态问题，有可能出现无法判读的情况；且该方法对于男性样本的阳性检出灵敏度要高于女性样本；一般从样本制备到检测出结果需要三天时间，耗时较长。