[发明专利]基因倒位突变检测方法

权利要求书

1.一种基因倒位突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)针对待测的基因组倒位突变区域，在区域内外设计对应的多组PCR引物，当检测样本为正常样本和发生不同类型基因组倒位突变的样本时，所述PCR引物的扩增产物在碱基序列上会存在差异；

2)根据需要检测的基因组倒位突变情况，将所述多组PCR引物在一个或多个反应体系内对待测样本进行低循环PCR预扩增获得预扩增产物；

3)针对所述PCR扩增产物，区分为倒位突变的野生型等位基因和突变型等位基因的差异碱基序列，设计对应的多重PCR引物，每对引物中的一条具有荧光标记；在倒位突变区以外的其他基因组区域选取至少一个参照基因片段，设计至少一对PCR引物，每对引物中的一条具有荧光标记，同种荧光标记的多重PCR引物对应的扩增产物的长度有差异；

4)设计针对上述标记DNA序列和参照基因序列的外源竞争DNA片段，所述外源竞争DNA片段与步骤3中对应的多重荧光PCR引物的扩增产物高度一致，为对应扩增产物的序列缺失或插入少数1-50个碱基的序列，该外源竞争DNA片段可以被步骤3中对应PCR引物扩增；

5)对所有外源竞争DNA片段进行定量；

6)将混合后的外源竞争DNA片段与一定量的步骤2中PCR预扩增产物或一定量的未扩增的正常样本基因组DNA混合，以二者的混合DNA片段为模板进行多重荧光PCR扩增；

7)扩增产物通过变性荧光毛细管电泳将不同长度的片段分开，得到每个条带的位置信息以及荧光强度；

8)根据数据分析预扩增片段的扩增谱来确定样本的基因型。

2.根据权利要求1所述的基因倒位突变检测方法，其特征在于：所述步骤2中低循环PCR预扩增的PCR循环数在40个循环以内。

3.根据权利要求2所述的基因倒位突变检测方法，其特征在于：所述步骤2中低循环PCR预扩增的PCR循环数为10-20个循环。

4.根据权利要求1所述的基因倒位突变检测方法，其特征在于：所述步骤3中的同种荧光标记的多重PCR引物对应的扩增产物的长度差异大于5bp。

5.根据权利要求1所述的基因倒位突变检测方法，其特征在于：所述步骤4中对应扩增产物的序列缺失或插入2-5个碱基的序列。

6.根据权利要求1所述的基因倒位突变检测方法，其特征在于：所述步骤5中对所有外源竞争DNA片段进行定量后按一定比例混合。

7.根据权利要求1所述的基因倒位突变检测方法，其特征在于：所述步骤8中数据分析包括：

a)计算每个DNA序列的样本条带(S)/外源竞争DNA(C)条带的荧光峰高或面积比(S/C)；

b)将标记DNA序列的S/C比值除以参照基因DNA序列的S/C比值获得该标记DNA序列的R值；

c)该R值除以未扩增的正常样本基因组DNA的R值再乘以未扩增的正常样本基因组DNA在该标记DNA序列上的拷贝数即可获得检测样本PCR预扩增产物在该标记DNA序列上的拷贝数，该拷贝数的大小可指示标记DNA序列在步骤2中是否获得了显著性PCR扩增，显著性PCR扩增是指计算标记DNA序列的拷贝数显著性高于线性扩增理论拷贝数；

d)若标记DNA序列的拷贝数高于线性扩增理论拷贝数的2倍即定义为标记DNA序列获得显著性PCR扩增；

e)基因型判定：若检测样本的野生型相关标记DNA序列获得显著性PCR扩增的，判定该样本的倒位突变基因型为野生型；

若检测样本的突变型相关标记DNA序列获得显著性PCR扩增的，判定该样本的倒位突变基因型为突变型；

若检测样本的野生型和突变型相关标记DNA序列均获得显著性PCR扩增的，判定该样本的倒位突变基因型为杂合型。