[发明专利]一种提高外源基因同源重组效率的方法

说明书

技术领域：

本发明属于基因编辑领域，尤其涉及CRISPR/Cas9系统和同源重组修复模板进行外源基因同源重组突变改造。

背景技术：

基因测序和全基因组技术的发展，对于研究基因表达、基因多态性和调控研究与特定基因、特定细胞功能和疾病状态的关联性提出了重大变革。这为研究基因组中编码和非编码序列的功能预测提供了便利。近年来，序列特异性的内切酶技术在模式动物精确基因编辑方面的应用取得了很大的进步，对我们对生物体发展和疾病研究起了很大的推动作用。

锌指核酸酶技术(Zinc-fingers)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)以及由RNA介导的CRISPR/Cas9核酸酶系统都已运用于基因编辑，在目的基因中引入所需要的突变，进而进一步的研究基因的功能已经运用于多物种。其中CRISPR/Cas9系统与其他基因组工程技术比较拥有以下技术优势：(1)无物种限制，靶向精确性高，可实现对靶基因多个位点同时敲除；(2)使用方便，费用更低，无论是锌指核酸酶技术(Zinc-fingers)还是转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)都需要针对不同靶点改变核酸酶前面的识别序列，这些识别序列的合成或者组装耗时费力且费用很高，但Cas9蛋白不具特异性，只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰；(3)CRISPR/Cas9系统只需要改变很短的RNA序列(不超过100bp)就可以实现不同位点的特异性识别，可避免超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。

CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。

目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(sgRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。