[发明专利]一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明创造属于生物技术领域，尤其涉及一种适用于EV71病毒抗原免疫检测的试剂盒及其制备方法。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员。此病毒能够袭击神经系统，引起神经性并发症如无菌性脑膜炎(asepticmeningitis)、缓性麻痹(acuteflaccidparalysis)和脑干脑炎(brainstemencephalitis)。婴幼儿手足口病(HFMD)和疱疹性咽峡炎(hermangina)是EV71感染的主要临床特征。此病多发于学龄前儿童，尤其以三岁及以下婴幼儿发病率最高。EV71病毒有四种基因型(A,B,C,D)，基因型B和C各含有五种亚型，其中C4aEV71的平均进化率比其它EV71基因型都迅速。重要核苷酸或氨基酸变异很可能使进化的C4a病毒神经毒力增加，导致中国大范围内爆发手足口病。2008年至2009年，由EV71病毒感染导致的死亡人数接近500例。国家手足口病监督系统的数据显示，从2008年到2012年，人群感染手足口病病死率为0.03％，严重病例占1.1％。

到目前为止还没有有效的抗EV71病毒疗法，所以控制EV71病毒传播依赖于病毒的快速早期检测和诊断。传统的EV71实验室诊断方法主要是病毒分离和病毒类型识别技术，但此类方法耗时长，妨碍病情的及时诊断，从而拖延疾病的治疗和实施预防措施。另一种诊断方法是先进行细胞培养，随后利用血清型不同的特异性抗血清进行病毒的中和实验。此方法也需要消耗大量的时间来获得结果，而且实验步骤更加繁琐，且需要经过专门培训的技术人员来操作，不能广泛的用于大多数实验室研究。尽管后来的分子学方法(反转录PCR法检测病毒基因组)能够做到准确有效的检测EV71病毒，但由于此方法需要特殊的仪器，并且也需要专门培训的技术人员来操作，检测费用相当昂贵，所以这种方法对于爆发EV71病毒感染的许多国家和地区来说并不适用。

酶联免疫吸附技术(ELISA)操作方便，灵敏度高，检测时间短，是非常高效且准确的检验病毒感染的方法。在EV71病毒的临床检测中，国内外现有的ELISA法检测试剂盒普遍使用的事捕获法，即先将抗人IgM抗体包被在酶标板上，加入血清样本后，抗人IgM将捕获血清样本中的待检IgM抗体，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。采用捕获法能够降低血清样本中特异性IgG抗体对于IgM抗体测定的干扰，但此方法操作复杂，检测时间相对较长，灵敏度较低。因此，在EV71病毒临床检测领域内，迫切需要一种高效且高灵敏性和特异性的定量检测IgM的诊断试剂盒产品。

发明内容

本发明创造为解决现有技术中的问题，提供了一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，能够快速简便地消除人血清样本中的特异性IgG抗体对于IgM抗体测定的干扰，提高检测便捷度和准确度。

本发明创造提供的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，包括EV71病毒抗原包被的酶标板、抗EV71病毒抗原IgM抗体标准品、辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液、浓缩洗液、类风湿因子吸附剂、样本稀释液、底物溶液和终止液。

其中，所述EV71病毒抗原包被的酶标板采用下述方法获得：

a)EV71病毒抗原包被液的配制：采用以下缓冲溶液将EV71病毒抗原稀释至25-2000ng/100μL；0.01-0.1MPBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0-8.0；0.05-0.1MCBS(碳酸盐缓冲溶液)，其pH9.0-9.6；0.05mol/LTris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液)，其pH10.0-10.6；

b)将3-5％的脱脂奶粉或者1-3％BSA(牛血清白蛋白)加入下述缓冲溶液中，配制成封闭液：缓冲溶液，0.01-0.1MPBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0-8.0；

c)包被酶标板：

i.将配制的EV71病毒抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-200μL被液；

ii.酶标板置于2-8℃环境下包被8-24h；

iii.将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-200μL封闭液置于37℃温箱，30-90分钟；

iv.从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温30-90分钟，即得。