[发明专利]一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用

说明书

本发明公开了一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用，所述方法提供在5`端含有限制性内切酶特异性识别序列，并标记有荧光基团和猝灭基团的一对交叉引物、一对置换引物，以及3～6条扩增引物恒温扩增目的基因片段并进行可视化检测、电泳检测、实时浊度检测及实时荧光检测。本方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

技术领域

本发明公开了一种核酸扩增技术，属于分子生物学领域。

背景技术

在现代医学和生物学领域，核酸扩增是一种不可缺少的技术，广泛运用于临床检测、基础研究、考古研究、流行病研究、转基因研究等领域。在已开发设计的核酸扩增技术中，PCR扩增技术是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，该技术已经被广泛运用于医学、生物及化学相关领域。

运用PCR技术进行核酸扩增时，依靠复杂昂贵的热循环设备，扩增产物的检测比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。因此，PCR技术的应用受到实验室条件的限制，这些劣势阻碍了PCR技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区，快速检测及现场诊断领域。对于生物及医学相关研究领域而言，非常有必要发展一个操作简单、检测快速、经济有效的核酸扩增方法。

近十年来，为了克服PCR扩增技术及衍生技术(如实时PCR)的劣势，应运而生了许多恒温核酸扩增技术。相比较PCR及衍生技术而言，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，整个扩增过程恒定在固定的温度，反应速度快，敏感性强，特异性高。有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。

到目前为止，已研发的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有SDA(链置换扩增)、HDA(解旋酶依赖的恒温扩增)、RCA(滚环扩增)、LAMP(环介导恒温扩增)、CPA(交叉扩增)等。然而，SDA、HDA技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂和复杂的操作步骤。RCA技术仅能扩增环状核酸序列，且反应时间长。LAMP及CPA技术实现核酸的扩增仅依靠一种置换酶，已经被广泛的运用于检测领域。然而，LAMP和CPA技术很难对一些含量极低的靶标进行检测(如感染早期的临床样本，血液样本)。因此这些扩增技术的实用性，便捷性，可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域以及欠发达地区。

为了克服现有恒温扩增技术及PCR相关技术的劣势，实现快速、简单、敏感及特异的核酸序列扩增，有必要建立一种操作简单、经济实用、反应快速、特异性强的核酸扩增技术。为了实现这一目标，本发明人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。在本发明中，为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。发明人以MCDA为基础，开发了能够同时检测多个靶标的多重实时MCDA技术，该技术被命名为内切酶介导的实时多交叉置换扩增(Endonuclease Restriction-Mediated Real-time Multiple CrossDisplacement Amplification,ET-MCDA)，ET-MCDA作为一种新的多重实时恒温核酸检测技术，能够广泛地用于生物、临床及相关领域，实现核酸的实时、快速及多重检测分析。

志贺菌(Shigella spp.)和沙门菌(Salmonella spp.)是两种重要的食源性疾病病原体，广泛存在于环境中的革兰氏阴性菌。志贺菌和沙门菌常分离自食品样本及临床标本，引起食源性的肠热症，临床症状表现为发热、腹泻。据WHO数据统计，全球每年有180万病人死于腹泻，而绝大多数病例是由志贺菌和沙门菌导致，从而受到全球卫生部门的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。在发展中国家，志贺菌是引起菌痢的最主要的病原体，然而，无论是在发展中国家还是发达国家，沙门菌是导致食源性疾病最重要的病原体。因此，为了给予临床病人快速准确的治疗，食源性病原体监测以及志贺菌和沙门菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的诊断方法，能够同时检测和鉴定志贺菌和沙门菌成为必要。