[发明专利]一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用

权利要求书

1.一种用于非诊断目的的扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；

(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物E-CP1，所述引物E-CP1自5’端依次含有一种荧光基团、一种限制性内切酶序列、序列C1和与序列P1s互补的序列P1，在所述引物E-CP1的限制性内切酶序列之后标记有荧光猝灭基团，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2；

(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和含有与序列C2s互补的扩增引物C2；

(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；

(5)检测步骤(4)的扩增结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中所述序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1和含有序列R1的扩增引物R1；或者

在步骤(1)中序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物CP2自5’端还依次含有一种荧光基团、一种限制性内切酶序列，在所述引物CP2的限制性内切酶序列之后标记有荧光猝灭基团。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增是在61-65℃中进行的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增是在63℃中进行的。

7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述链移位型聚合酶为Bst DNA聚合酶，所述解链温度调节剂为甜菜碱。

8.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的检测为可视染料检测、电泳检测、实时浊度检测或实时荧光检测。