[发明专利]产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产环糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程 和酶工程领域。

背景技术

L-抗坏血酸（即维生素C，VC）是一种人体自身不能合成但在体内发挥重要生理作 用的水溶性维生素。可用来防止坏血病，促进伤口愈合；还可作为还原剂，紫外线吸收剂和 黑色素形成抑制剂用于化妆品中。但位于2位碳的羟基极不稳定，导致VC还原性强，极不稳 定，易被热和氧化剂破坏，尤其是光，重金属等物质能促进其氧化，使其在应用方面收到限 制。

2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸（AA-2G）是一种L-抗坏血酸的衍生物，是由日本 林原生物化学研究所与冈山大学药学系共同发现的，可作为美白剂添加到化妆品中，且由 于VC分子上的C-2羟基被葡萄糖苷所取代，其C-2位上有葡萄糖基掩蔽，故其具有较高的稳 定性和抗氧化性，是良好的VC替代品。

用于催化VC生成AA-2G的酶有以下五大类，分别为环糊精葡萄糖苷转移酶，α-淀粉 酶，蔗糖磷酸酶，α-异麦芽糖基葡糖基形成酶，α-葡糖苷酶。其中最具工业化前景的两种酶 为环糊精葡萄糖苷转移酶和α-异麦芽糖基葡糖基形成酶，使用环糊精葡萄糖苷转移酶的最 多。α-异麦芽糖基葡糖基形成酶因其酶表达量很低，不利于AA-2G的生成，因此一般要和环 糊精葡萄糖苷转移酶一起使用。环糊精葡萄糖苷转移酶的主要来源是细菌Bacillus和 Klebsiell属。该酶最大的优势为转化效率较高，但在反应过程中会生成中间产物AA-2Gs， 故需要进一步利用葡糖淀粉酶将其水解为AA-2G，但目前CGTase的酶活比较低，相关文献中 Peanibacillusmacerans产出的CGTase胞内酶活水平在0.8U/mgDCW左右。

E.coli具有遗传背景清楚、生长速度快、成本低、表达量高、操作简单、表达产物易 纯化等优点，是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的经典表达系统。然而，由于 E.coli过高的表达水平以及缺乏真核生物的蛋白加工体系，容易导致错误折叠的蛋白聚集 形成包涵体，产生没有活性的酶。常用的促进蛋白可溶性表达的方法有降低蛋白合成速度， 如降低诱导温度；优化培养条件，如优化培养基，诱导时间；利用分子伴侣和折叠酶等辅助 蛋白共表达等。通过以上方法，均可有效提高蛋白可溶性表达，从而提高酶活。

分子伴侣的概念是由Lasky在1978年首先提出的，他将细胞核内能与组蛋白结合 并介导核小体有序组装的核质素称为分子伴侣。根据ELLis的定义及后续研究，分子伴侣概 念延伸为：它们结合并稳定其它蛋白质的不稳定构象，通过可调控的结合和释放，促进细胞 内蛋白质的正确折叠、跨膜转运、寡聚体组装、蛋白与细胞内其它组分的相互作用、有活性 和无活性蛋白构象的转换、胞内转运以及蛋白质降解；并且当底物蛋白恢复到正确的天然 结构并发挥正常生理功能时，分子伴侣不再与底物蛋白结合。DnaK属于Hsp70家族，其辅助 伴侣为DnaJ（属于Hsp40家族）和核苷酸交换因子GrpE。部分科学家认为，DnaK的结合能使去 折叠蛋白保持在可折叠状态。当去折叠蛋白从DnaK解离后，一部分能够自发折叠成天然构 象。而另一部分折叠缓慢的中间体能反复被Hsp70系统结合与释放，从而阻止肽链中间体的 错误聚集，促进蛋白质正确折叠。经过该系统后，将有5-18％的蛋白质折叠为天然结构。 GroEL属于伴侣蛋白，其辅助伴侣为GroES。当蛋白质翻译完成后，利用DnaK系统不能实现正 常折叠的蛋白将被转移至伴侣蛋白。故可将分子伴侣和含目的基因的质粒一起导入，有效 地使蛋白正确折叠，从而提高酶活。

目前，在生产AA-2G方面，日本林原公司在市场上占有垄断地位。AA-2G的价格是VC 的100多倍，可见其具有较高的市场价值，但在我国，对于生产AA-2G的研究尚在初步探究的 阶段，还未达到工业化的水平，并且其后的分离提纯工艺也需耗费人力物力，有效提高转化 率，节约生产成本，简化生产工艺也是当务之急。

在糖基供体的选择中，α-环糊精转化率高，但其价格较为昂贵，不适合工业化生产 使用；β-环糊精溶解性较低，转化率略低，但价格便宜；其余的糖基供体转化率很低。因此， 本发明过程后期的转化过程选用β-环糊精作为糖基供体，由于其溶解性低，故采用多次分 批添加β-环糊精，提高AA-2G的产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提高环糊精葡萄糖苷转移酶的酶活，提供一种产环 糊精葡萄糖苷转移酶的基因工程菌及其应用。