[发明专利]免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法

说明书

本发明提供一种免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法：以副溶血性弧菌为模板，克隆Vp种特异性toxR_28‑534基因，原核表达并纯化；制备针对toxR_28‑534蛋白的多克隆抗体；将多克隆抗体与氨基磁珠微球偶联；合成生物素标记的靶标DNA和LAMP法检测所需引物，利用链霉亲和素偶联抗体和靶标DNA，制备抗体‑DNA偶联物；取待测液，与抗体偶联的磁珠混合，使用磁力架分离磁珠‑菌体，重悬后与抗体‑DNA偶联物混合，然后以磁珠‑菌体‑抗体‑DNA偶联物为模板，使用LAMP法扩增检测。该发明提出通过免疫磁珠技术捕获特异蛋白分子再进行放大后检测，从而缩短检测时间，便于现场操作。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种抗体-DNA偶联物的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是革兰氏阴性的嗜盐弧菌，广泛分布于港口、海水沿岸、海河交界处等，主要通过污染的海产品引起人类急性胃肠炎及旅行者急性腹泻、伤口感染和败血症。近几年来，食用海产品的人群在不断扩增，越来越多的人开始追求一些海鲜刺身。国家食源性疾病监测网数据显示我国微生物性食物中毒的病原分布发生显著变化，特别是在沿海省份，副溶血性弧菌引起的食物中毒发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已高居微生物食物性中毒首位。副溶血性弧菌同时也能感染鱼、虾、蟹类以及甲壳类等多种水产动物，对养殖业造成不利。目前，美国和欧盟对进口水产品都强制性要求进行副溶血性弧菌的检测，检测结果为阴性方可通关。

副溶血性弧菌致病性机理较复杂，其致病因子有溶血性毒素、尿素酶、粘附因子和侵袭力。副溶血性弧菌的跨膜转录调控蛋白toxR参与调控主要毒力基因和外膜蛋白的表达，由toxR基因编码，是弧菌科种间鉴定的良好分子靶标，toxR基因可在种的水平上检测副溶血性弧菌。

副溶血性弧菌滋生速度快，尤其在每年的5月-8月，更容易引发大面积的细菌性食物中毒事件，Vp的快速检测技术显得尤为重要。目前，我国副溶血性弧菌的传统检测手段以微生物培养法为主，全程大概需要5-8天，操作繁琐耗时，已不能够满足人们对食品安全检测的快速简便的要求。所以，迫切需要研发出灵敏度更高、特异性更强、快速简便的检测手段，来监控食源性致病菌，以保障人们的食品安全。

技术的不断进步推动检测方法的发展，目前已经有越来越多的方法用于快速检测副溶血性弧菌，如PCR技术、酶联免疫吸附法(enzyme-labeled immunosorbent assay，ELISA)、实时定量荧光PCR法(Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)以及环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。

PCR技术通过特异性扩增可在短时间内放大检测目标，具有灵敏度高的特点，但是PCR检测操作过程的要求高且易出现假阳性。ELISA法利用抗原-抗体的特异性结合检测致病菌，对设备的要求较低，但灵敏度相对而言较低，在食品安全微生物检验中应用并不广泛。FQ-PCR能定性检测和定量分析靶分子，但在试剂和仪器费用方面价格不菲。此外，以上的检测方法均需要操作人员具有熟练的操作技巧和一定的专业水准，因此，昂贵的仪器设备、较高的检测费用和严格的技术要求限制了这些技术的现场快速检测和基层普及应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是2000年日本学者Notomi等建立的核酸等温扩增技术，是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，使LAMP反应具有极高的扩增特异性，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(约65℃)保温约60min，即可完成目的基因扩增反应，从而克服了PCR反应需要反复的热变性获得单链模板的缺点，避免反复升降温的耗时过程，具有简单、快速、特异性强、敏感性高的特点，而且LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有利于在一些基层机构和现场检测的应用。