[发明专利]免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法有效
| 申请号： | 201610134920.1 | 申请日： | 2016-03-10 |
| 公开（公告）号： | CN105755118B | 公开（公告）日： | 2020-01-21 |
| 发明（设计）人： | 刘涛;陈健;斯国静;俞骅;楼秀芹;张蔚 | 申请（专利权）人： | 杭州市疾病预防控制中心 |
| 主分类号： | C12Q1/6804 | 分类号： | C12Q1/6804;C12Q1/6844;C12Q1/10 |
| 代理公司： | 33251 嘉兴海创专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 章松伟 |
| 地址： | 310021 浙江省杭州市江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 免疫 磁珠环介导 等温 扩增 快速 检测 溶血 弧菌 方法 | ||
1.一种免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于包括以下步骤：
S1：以副溶血性弧菌为模板，克隆Vp种特异性toxR28-534基因，原核表达并纯化跨膜转录调控蛋白toxR28-534；
S2：通过免疫大白兔制备针对toxR28-534蛋白的多克隆抗体；
S3：将制备的toxR28-534蛋白多克隆抗体与氨基磁珠微球偶联，制备抗体偶联的磁珠；
S4：利用生物信息学方法人工合成生物素标记的靶标DNA和LAMP法检测所需的引物序列，将制备的多克隆抗体与生物素偶联，然后利用链霉亲和素偶联生物素化的抗体和生物素标记的靶标DNA，制备抗体-DNA偶联物；
S5：取待测液，与抗体偶联的磁珠混合，待靶标抗原充分结合后使用磁力架分离磁珠-菌体，分离的磁珠重悬后与抗体-DNA偶联物混合，使充分结合，然后以得到的磁珠-菌体-抗体-DNA偶联物为模板，使用LAMP法扩增检测待测液中副溶血性弧菌；
所述步骤S1中副溶血性弧菌为副溶血性弧菌标准菌株ATCC 17802；
所述步骤S1中Vp种特异性toxR基因为去除信号肽序列和跨膜区部分的ToxR基因片段ToxR28-534，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于：所述步骤S1中原核表达的表达载体为pET-28a(+)。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于：所述步骤S3中多克隆抗体与氨基磁珠微球偶联时按1∶2.5的体积比混合。
4.根据权利要求1所述的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于：所述步骤S4中靶标DNA为弓形虫基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求1所述的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于：所述步骤S4中LAMP法检测所需的引物序列具体如下：F3如SEQ ID NO：7所示，B3如SEQ ID NO：8所示，FIP如SEQ ID NO：9所示，BIP如SEQ ID NO：10所示。
6.根据权利要求1所述的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于：所述步骤S4中多克隆抗体与生物素按100∶1的体积比混合，生物素化抗体、链霉亲和素、生物素标记的靶标DNA按1∶1∶1的摩尔比混合。
7.根据权利要求1所述的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于：所述步骤S5中待测液与抗体偶联磁珠的混合体积配比为5∶1。
8.根据权利要求1所述的免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法，所述方法用于非疾病诊断治疗目的，其特征在于：所述步骤S5中重悬磁珠与抗体-DNA偶联物混合的混合体积配比为7.5∶1。
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