[发明专利]高效耐受和利用甲醇的酵母菌株及应用

说明书

本发明提供一种高效耐受和利用甲醇的酵母菌株，该菌株是传统毕赤酵母菌株经连续传代驯化获得，与传统毕赤酵母菌株相比该菌株耐受高浓度甲醇和利用甲醇的能力得到大幅提升。在甲醇为唯一碳源的培养基中，驯化菌株的比生长速率与出发菌株相比至多提升1.95倍。该菌株的优良特性使其具有非常良好的工业应用前景，可广泛用于利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高值化学品。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能高效耐受和利用甲醇的酵母菌株及应用。

背景技术

甲醇作为一种古老的有机原料，是仅次于乙烯、丙烯和苯的基本有机原料，其需求与国民经济的增长密切相关，近年来随着中国经济的持续增长，甲醇的需求也出现大幅增长，年均增长率保持在10％～15％，与此同时，甲醇的生产能力也在稳步提升，据权威统计，2012年中国甲醇行业共有企业近300家，产能达到5149.1万t，产量为3129万t。由于中国是缺油少气、煤炭资源相对丰富的国家，随着国家产业政策调整和技术进步，目前中国甲醇产能中以煤为原料约占66％，以天然气为原料约占23％，以焦炉气为原料约占11％。甲醇作为重要的基础化工原料，在传统下游应用，包括塑料、合成纤维、合成橡胶、胶粘剂、染料、涂料、香料、医药和农药等方面有着重要的作用，近年来随着煤化工国产化工艺技术及装备大型化取得突破，醇醚燃料、甲醇制烯烃/芳烃等新兴煤化工产业发展前景乐观。另外，基于国际石油价格上涨和中国汽油消费量大幅增加的发展趋势，甲醇汽油、甲醇燃料和二甲醚等新型燃料也将随着标准的完善和销售网络的建设，成为甲醇新的消费增长点。随着生产工艺的改进与社会需求的变大，甲醇的生产成本也在初步降低，2006年，中国国内均价甲醇是2936元/吨，而到2012年，已经变成了2650元/吨，目前的生产成本已经低于传统的工业原料葡萄糖和甘油，可以预知，未来若干年，甲醇将成为十分重要的原料。

1969年，Kiochi Ogata首次报道，发现一种特别的能够以甲醇作为唯一的碳源和能源的酵母菌，这种嗜甲醇酵母立刻引起人们极大关注。由于甲醇的经济性，这种生物体可作为一种单细胞蛋白(Single cell protein，SCP)推向市场，成为高蛋白的动物饲料。70年代，Philips Petroleum公司发展了该菌株适应在甲醇中高密度连续培养的培养基和方法，使细胞产量高达130g干细胞/升。不幸的是，随之而来的石油危机导致甲醇价格急剧上升，使得人们不再重视利用甲醇生产单细胞蛋白。这种酵母即为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，由于其细胞内含有甲醇代谢途径所必需的酶，如乙醇氧化酶(Alcoholoxidase，AOX)、二羟丙酮合成酶(Dihydroxyacetone synzyme，DHAS)和过氧化氢酶(Catalase，CTS)等，其中AOX是甲醇代谢途径中的十分重要的酶，也是催化甲醇代谢第一步反应的酶，它能使甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢，过氧化氢酶又降解过氧化氢为氧气和水，过氧化氢又进一步氧化甲醛为甲酸和CO₂，这样通过两种脱氢酶的作用使细胞以甲醇为唯一碳源。由于AOX与氧的亲合力低，所以P.pastoris在以甲醇为唯一碳源时，会代偿性产生大量的AOX，约占全部可溶性蛋白质的30％，而在以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX，这说明AOX基因启动子具有明显的调控功能,可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的：外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。一般来说，毕赤酵母在表达外源蛋白的大规模高密度发酵过程中，主要分为两个阶段，即菌体生长增殖阶段和诱导外源蛋白表达阶段。在菌体增殖阶段，细胞通常以甘油或葡萄糖为碳源进行扩大培养，在获得所需要的菌体密度后，再进入外源蛋白诱导表达阶段。外源蛋白表达阶段是以甲醇作为唯一碳源并且诱导目的蛋白表达。在这个过程中，甲醇的精确流加是确定外源蛋白表达的关键，流加速率过高超过了毕赤酵母对于甲醇的利用速率，就会在过程中积累高浓度的甲醇。过量的甲醇会严重抑制细胞活力和产物的表达，甚至可导致菌体死亡。因此，在应用上往往通过溶氧控制、甲醇离线/在线控制或甘油/甲醇混合补料等工艺来避免甲醇可能对于酵母宿主带来的毒害。但上述工艺调控，操作复杂并会增加生产成本。因此提高菌株对甲醇的耐受性，增加甲醇的利用速率，将是解决毕赤酵母甲醇毒性的有效策略，同时也会显著缩短酵母培养的周期，提高生产强度，降低生产成本。