[发明专利]一种基于腺苷受体A2A分子探针的药物活性成分筛选方法

权利要求书

1.一种基于腺苷受体A2A分子探针的药物活性成分筛选方法，其 特征在于，所述的筛选方法包括了以下步骤：

步骤1：构建腺苷受体A2A分子探针：

A.采用Clontech试剂盒，将人腺苷受体A2A的cDNA连接到实验室 现有载体pcDNA5/FRT/TO-VSV-G-eCFP上，从而得到 pcDNA5/FRT/TO-VSV-腺苷受体A2A-eCFP质粒；

B.用Clontech试剂盒将eYFP的cDNA连接到受体第三内环中 部，从而得原始的分子探针质粒；

C.用探针质粒转染HEK293细胞48小时,以表达受体分子探针， 并用市售的受体激动剂激活探针，用Olympus高速荧光显微镜监测 探针的灵敏度；

D.根据探针灵敏度的监测结果，对探针进行结构优化；

步骤2：建立诱导表达G蛋白偶联受体分子探针的Flp-InT-Rex HEK293细胞系：

A.将优化后的分子探针质粒和pOG44载体共转染Flp-InT-Rex HEK293细胞,并用200ug/mlHygromycin筛选阳性细胞克隆；

B.用1ug/mlDoxycycline诱导细胞表达相应的G蛋白偶联受 体分子探针，用VSV抗体检测探针蛋白的表达，用荧光显微镜监测 分子探针的细胞定位；

C.用受体激动剂处理已经表达的受体分子探针Flp-InT-Rex HEK293细胞，得到不同激动剂剂量的受体激活的FRET曲线，并在停 止给药后继续用生理盐水洗脱激动剂。

2.如权利要求1所述的一种基于腺苷受体A2A分子探针的药物活 性成分筛选方法，其特征在于：所述的步骤1中对探针进行结构优化 具体如下：

调整eYFP在受体第三内环的位置：将受体第三内环分别截短至 两端各保留12个氨基酸，优化前探针的eYFP位于受体第三内环的中 间位置，优化后探针的eYFP位于受体第三内环的211-222位置，eCFP 位于受体C-末端的412位置。