[发明专利]一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法

说明书

本发明涉及真菌分子生物学领域，具体是一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器快速提取方法，所述方法将化学裂解法和酶裂解法两大酵母破壁方法巧妙整合，结合抽吸装置、过滤装置以及核酸提取注射器，无需供电设备在1.5到3小时内完成DNA提取，是目前唯一的酵母菌无仪器DNA高效提取方法。本发明的提取方法具有快速简便、灵敏、无毒、低成本等优点，可适用于绝大部分酵母样真菌。

技术领域

本发明涉及真菌的分子生物学研究领域，具体地说，是一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA无仪器提取方法。

背景技术

近几十年来，生物医学领域的巨大进步促进了人类疾病防控能力的显著提升。然而，随着造血干细胞和实体器官移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂、广谱抗生素、各种置管技术的广泛使用及HIV在全球的持续蔓延，各种侵袭性真菌感染的发病率及死亡率在全球呈显著上升趋势。酵母样病原真菌既包括新生隐球菌(Cryptococcus.neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus.gattii)、白念珠菌(Candida albicans)等酵母菌，也包括一些温度变化型双向真菌(Thermally Dimorphic Fungi)，比如组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)在常温(22-28℃)下为菌丝形态，而在人体37℃状态下呈现酵母形态。由于上述酵母菌和双向真菌菌的组织形态具有很大的相似性，对于没有系统深厚病原真菌学基础的检验人员，难以通过形态学确诊，并且真菌感染疾病谱正发生变化，不同病种治疗药物差异较大，非基于病原体确诊的经验性抗真菌治疗效果有限。直接镜检通常敏感性不够高，存在一定的假阳性和假阴性。真菌培养往往需要很长时间(一周到一个月)，而临床急诊的救治工作争分夺秒，确诊时常常错过最佳诊治时机。血清学检测是临床侵袭性真菌感染的重要检测方法，然而其影响因素较多，存在不同程度的假阳性和假阴性结果。与传统方法相比，分子生物学检测手段因其高灵敏度、高特异性及检测时间短等优点，为不易培养病原真菌的快速检测和鉴定、抗真菌药物抗性检测以及宿主组织体液的直接性快速检测带来了希望，是未来真菌感染性疾病诊断的新趋势，具有重大的发展前景。

传染病的早期诊断对于治疗策略的选择以及患者的预后其决定作用。研究发现，在某些情况下，无论是什么病原菌侵袭性感染，延误诊断一小时病死率增加7％。同时，早期诊断可以降低后续的治疗成本，减轻患者经济负担。分子诊断的出现，满足了传染病早期快速的要求。一般检测仅需2个小时就能得出检测结果，而常规病原体检测(比如病原体培养)则需要几天时间。现在分子诊断主流的市场是高端人群，主要应用于富裕国家或者地区的大型医学中心或者中心实验室。一般该检测需要配套大型自动化仪器，比如核酸提取需要用到离心机、细胞破碎仪等、核酸扩增需要用到PCR仪等；同时需要配备经过额外培训的操作人员，所以运行成本以及检测费用也相应较高。

相比于发达国家或者地区，发展中国家一直是传染病肆虐的重灾区，发病率高，病死率高，治疗费用难以负担。然而，在我国以及世界上很多发展中国家以及地区，基层医疗场所难以提供大型诊断仪器，更是无法负担大型诊断仪器的运转和维护；患者也无法承担高昂的检查费用。故现今在早期诊断方向的大量科研成果，尤其是分子诊断技术，无法惠及该人群，而这些诊断技术恰恰是这部分人最需要的。同时，大型仪器携带不便，限制了分子诊断技术在现场调查的应用。所以，诊断和治疗手段的缺乏导致了传染病扩散、疫情恶性加剧。