[发明专利]一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程领域，具体地说是一种牛肌腱胶原蛋白的提取方 法。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是一种生物性高分子物质，是一种白色、不透明、无 支链的纤维性蛋白质，主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体皮肤、 血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，是这些结缔组织的主要物 质基础。

大多数的胶原蛋白在天然状态下不溶于水，在体内以胶原原纤维或称胶原 纤维的形式存在。胶原原纤维的基本结构单位是原胶原分子，肽链(亚基)相互缠 绕成独特的三股右手螺旋结构。由于上述结构非常稳定，胶原蛋白很难被生物 学降解，只有少数的蛋白酶能够在特定的pH和温度条件下水解胶原纤维，这类 酶被称为胶原蛋白酶。按照其来源，胶原蛋白酶可以分为微生物胶原蛋白酶和 动物胶原蛋白酶。其中，哺乳动物胶原蛋白酶以基质金属蛋白酶为主。

目前国内外的胶原蛋白主要从鱼皮、动物皮及肌腱中提取制备，临床上胶 原海绵是无过敏性、无菌冻干胶原，是促进伤口痊愈的特效药,还可作为各种外 科手术填充剂和止血药,疗效显著，用途广泛。

一般胶原蛋白的提取主要采用酸溶、酶解、盐析等方法，最后冻干成品经 干热病毒灭活和钴-60辐照。公告号为CN100366303C的发明专利公开了一种肌 腱、韧带防粘连生物膜的制备方法，以牛肌腱组织为基料，经过除杂、清洗、 酸、碱、酶处理、硫酸软骨剂交联，冷冻干燥、灭菌后制得蛋白纯度在95％以 上的医用胶原蛋白。

但是上述方法并未公开具体的工艺参数，例如用何种酶处理、处理时间， 而现有的制备方法又存在以下缺陷：酶解过程中采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和 胃蛋白酶，反应时间长，收率低，纯度低，生产的胶原蛋白材料存在机械性能、 生物稳定性等方面的缺陷，限制其实际应用。为克服上述缺点，也采用高电压 脉冲法提取，但是仍然无法达到令人满意的效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种收率高、生产周期短、产品纯度 高的牛肌腱胶原蛋白提取方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种牛肌腱胶原蛋白 的提取方法，包括如下步骤：

将牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.05％～0.15％ 牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在38℃～42℃酶解后，得酶解液；

将酶解液离心后，取沉淀，用0.08％～0.12％乙酸溶解后过滤，得滤液；

将滤液盐析，得盐析液；

将盐析液离心，取沉淀，用水溶解后再加0.08％～0.12％乙酸继续溶解，得 胶原蛋白液；

将胶原蛋白液冷冻干燥后，即得牛肌腱胶原蛋白。

本发明的有益效果在于：提取效率高，现有的提取方法每千克肌腱能提取 86.7克胶原蛋白产品，采用本发明方法收率能提高到106.2克，收率提高近20％； 产品纯度高，紫外扫描图谱呈现在250～500nm之间均无吸收峰，同时在180～240 nm之间有强吸收峰，表明在波长280am附近无吸收峰，不含杂蛋白；而在230 am及以下存在强烈的吸收峰，表明胶原蛋白的羰基及肽键的特征吸收峰强，胶 原蛋白含量近100％；生产周期短，由原来的两天时间现缩短至一天，原有的酶 解时间需长达8小时，而采用适冷蛋白酶MCP-01酶解时间可控制在4小时内， 当日就能完成生产过程；产品弹性好，亲水性强，生物相容性好。

附图说明

图1为本发明的流程图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并 配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：用适冷蛋白酶MCP-01在缓冲液体系下水解肌 腱，使胶原微纤维中的胶原三螺旋分子暴露，胶原纤丝发生膨胀和松散，使其 快速水解且水解充分，进而提高收率和产品纯度。

请参照图1，一种牛肌腱胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：

将牛肌腱放入Tris-HCL缓冲液中，然后向所述缓冲液中加入0.05％～0.15％ 牛肌腱重量的适冷蛋白酶MCP-01并在38℃～42℃酶解后，得酶解液；

将酶解液离心后，取沉淀，用0.08％～0.12％乙酸溶解后过滤，得滤液；

将滤液盐析，得盐析液；