[发明专利]分泌抗马铃薯Y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗马铃薯Y病毒(PVY)单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。利用差速离心法提纯的PVY病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗PVY单抗的杂交瘤细胞株3B2，其保藏号为CGMCC No.12001。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10^‑7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与30kDa的PVY外壳蛋白有特异反应。利用3B2单抗建立检测作物上PVY的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue blot‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:10240倍稀释(w/v,g/mL)。抗PVY单抗的制备及其检测方法的建立为该马铃薯病毒病的诊断和检测、流行病学分析及科学防控提供物质和技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗马铃薯Y病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害马铃薯、烟草等农作物的重要病毒之一，在全球广泛传播并造成严重经济损失。PVY是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表成员，1931年由Smith在马铃薯中首次发现。马铃薯Y病毒属是植物病毒中最大的属，确定和可能的种约有200个，该属的病毒能侵染茄科、藜科、豆科、葫芦科等多种植物并造成重大的经济损失。自1953年起PVY在欧洲马铃薯种植区广泛流行，20世纪70年代该病毒扩展到美洲，到上世纪90年代初该病毒在亚洲开始发生流行，目前该病毒在世界各地均有发生危害。PVY引起的症状因寄主品种和病毒株系的不同而有所差异，典型的症状包括重型花叶、叶脉坏死、垂叶条斑坏死等，可引起马铃薯产量损失高达80％。研究发现PVY的初侵染源主要是带毒种薯，病原通过种薯调运可作远距离扩散，在马铃薯田块PVY也可以通过病汁液和携毒蚜虫传播。PVY粒子为弯曲线状，无包膜，大小为730×11nm，基因组全长约10kb，5’-末端共价结合基因组连接病毒蛋白(genome-linked viral protein,VPg)，3’-末端有Ploy(A)。基因组只包含1个大的ORF，编码1个约360kDa的多聚蛋白，该多聚蛋白可裂解成11个成熟的功能蛋白，其中包括一个29.8kDa的外壳蛋白。

防治PVY主要采用抗病毒育种和生产无毒种薯的方法，而快速、准确、灵敏、特异的病毒检测技术是抗病毒育种和生产无毒种薯的关键。与常规的指示植物检测、电镜检测、分子生物学检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点。目前已有关于PVY抗体制备和血清学方法的报道，但已报道的PVY抗体和血清学方法的检测灵敏度欠佳，为此，本发明以纯化的PVY病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗PVY的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测PVY的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国PVY的检测和诊断、流行病学的调查、无毒种薯的生产、病毒基因组功能的分析及其科学防控体系的建立提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗马铃薯Y病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗马铃薯Y病毒单抗杂交瘤细胞株3B2，它能分泌抗马铃薯Y病毒单抗，杂交瘤细胞株3B2于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12001。

一种所述的杂交瘤细胞株分泌的抗马铃薯Y病毒单抗，抗马铃薯Y病毒单抗腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，与马铃薯Y病毒30KDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现单抗检测感染马铃薯Y病毒病叶的灵敏度分别达到1:81 920和1:10 240倍稀释(w/v,g/mL)。