[发明专利]一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂，由NK细胞和更昔洛韦滴眼液组成。

2.如权利要求1所述的治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂，所述滴剂中含有的NK细胞 密度为1×10⁷～1×10⁸cell/mL。

3.一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞滴剂的制备方法，包括以下步骤：

NK细胞的分离纯化：

1)采集外周血，并用Ficoll法分离外周血单个核细胞，用PBS洗涤细胞1次；

2)向每5×10⁶～2×10⁷个外周血淋巴单核细胞中加入90μL磁珠分离缓冲液，重悬后在 细胞悬液中加入10μLCD5(Ly1)磁珠，4℃下孵育15min；

3)加入1mL缓冲液重悬，1500rpm离心5min，弃上清；倒入经缓冲液润洗过的MidiMACS 分选器的LD分离柱中，收集从分选柱中流出的细胞，用1mL缓冲液洗柱，重复1次，收集 全部过柱液；

4)细胞计数，1500rpm离心5min，弃上清，向每10⁷细胞加入90μL缓冲液重悬；

5)在上述细胞悬液中按10μL/5×10⁶～2×10⁷个细胞的量加入CD49b(DX5)磁珠，充分 混匀，4℃～8℃孵育15分钟，以10⁷细胞/mL缓冲液重悬，1500r/min离心10分钟，弃上清 液，500μL缓冲液重悬，置MS分离柱于MidiMACS分选器中，2mL缓冲液润洗LD分离柱， 将细胞悬液加入分离柱中，收获从分选柱中流出的细胞，待悬液快流尽时，加入500μL缓冲 液洗柱，重复3次；

6)将MS柱移出磁场，加入1mL缓冲液，快速打下NK(CD3^-DX5⁺)细胞，1500r/min离 心10分钟，弃上清液，100μL/10⁶缓冲液重悬，纯化得到外周血NK细胞；

NK细胞的扩增培养：

7)向纯化后的外周血NK细胞中添加细胞培养液进行培养，细胞密度为1×10⁶/mL；同 时向培养液中添加终浓度分别为100U/mL的IL-2和200U/mL的IL-12；

8)置于5％CO₂培养箱内，37℃下培养扩增14天，每隔2-3天补充上述细胞因子；

9)待细胞生长至总数为4×10⁷～5×10⁸个细胞时，用流式细胞术鉴定NK细胞和台盼蓝 计数测试NK细胞活力；

NK细胞滴剂的制备：

10)选取经过流式细胞术鉴定和台盼蓝染色，纯度超过90％、并且总数达到4×10⁷～5×10⁸的NK细胞，离心去除上清液，利用注射用生理盐水清洗1-2遍，400g离心5min，收集NK 细胞；

11)用更昔洛韦滴眼液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁷～1×10⁸cell/mL，制成NK细胞 滴剂。

4.一种NK细胞滴剂用于治疗病毒性角膜炎的用途。