[发明专利]一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法

说明书

本发明提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。该方法包括：(1)将微生物培养液离心、取上清液；(2)将一部分上清液加热；(3)将经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液混合，35‑45℃反应2‑3小时，终止反应，离心，取上清转移至多孔板，加入强碱溶液，检测450nm吸光值；(4)将450nm吸光值换算为胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；胞外蛋白酶的耐热性为经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。本发明方法可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，更加精确比较菌株之间的差异，使操作更便捷，节省了培养基，能够实现批量操作并可直接检测菌液上清。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地涉及一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。

背景技术

微生物在牛乳生产链过程中分泌的胞外耐热蛋白酶会导致牛乳及制品产生凝胶，沉淀和变苦。现有的脱脂乳平板筛查技术，利用向培养基中添加脱脂乳，通过对微生物的培养，观察是否有水解圈的形成来判断微生物的酪蛋白水解活力，操作简单，但是只能检测微生物是否有酪蛋白水解活力，而不能精确定量地检测和比较酪蛋白水解活力。现有的偶氮酪蛋白检测技术，利用微生物对偶氮酪蛋白底物的降解，释放具有特定紫外吸收波长的产物，通过检测产物的紫外吸收值，同时结合检测菌体生长浓度，可以实现对微生物酪蛋白水解活力的定量检测，但是由于需要同时检测菌体浓度，导致检测过程复杂且不能实现批量检测。最近报道的偶氮酪蛋白检测技术直接对培养基上清进行检测，可以不依赖菌体浓度，能够对胞外蛋白酶的酪蛋白水解活力定量测试，但未能对其酪蛋白水解活力及耐热性同时进行定量、批量检测未能实现对胞外蛋白耐热性的检测，且在菌株复壮培养中，培养基体积在5-8毫升，需要用试管培养，不利于批量操作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前检测胞外蛋白酶活性的方法不能同时批量地检测胞外蛋白酶耐热性，提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。本发明的检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法可以1)可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性进行定量测试，通过得到的不同样品之间的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性和耐热性差异可以更加精确比较菌株之间的差异；2)所有处理操作，都可以在1.5ml的离心管中进行，节省了试管到离心管的转移步骤，菌株培养以及处理后可以直接离心，使得操作更加便捷；3)节省了培养基的使用；4)通过酶标板的使用能够实现批量操作；5)不需要考虑菌体浓度，可以直接检测菌液上清，比较一定体积单位中胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性。

本发明为解决上述技术问题提供了以下技术方案：

本发明技术方案之一：一种同时、批量检测微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将微生物培养液离心、取上清液；

(2)将一部分步骤(1)所述上清液90-100℃加热1-3min，得经过热处理的上清液，剩余的步骤(1)所述上清液为未经过热处理的上清液；

(3)将步骤(2)中所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体积比1∶0.5-1∶2分别混合，所述反应缓冲液的组分为2-4.5g/L偶氮酪蛋白、25-45mM吗啉丙磺酸(MOPS)和1.5-3mM氯化钙，35-45℃反应2-3h，加入1.5-3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸终止反应，离心，取上清转移至多孔板，向所述上清中加入强碱溶液至强碱终浓度为0.2-0.5M，分别检测450nm吸光值；

(4)将步骤(3)所得450nm吸光值分别换算为步骤(2)所述经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性，所述换算的方法为将样品在450nm处的吸光值减去空白对照在450nm的吸光值得吸光值增值，再将所述吸光值增值换算为每毫升样品每小时的吸光值增值即得所述胞外蛋白酶酪蛋白水解活性；所述胞外蛋白酶的耐热性为所得经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。