[发明专利]利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛角膜基质的制备方法，尤其是一种利用新鲜牛角膜以 制备牛角膜基质的方法及应用方法。

背景技术

角膜疾病是全球第四大致盲病患，据世界卫生组织数据，全球范围内， 角膜疾病是仅次于白内障、青光眼、老年性黄斑部病变的第四大致盲病患， 约占5.1％。2006年《第二次全国残疾人抽样调查统计结果》表明，因角膜病 致盲患者约400万人，且每年新增10多万患者，其中约200万可以通过角膜 移植手术复明，但每年施行的角膜移植手术例数为4000-5000例，大量患者因 没有供体来源而失明，约300万患者在“等米下锅”，而不准用死刑犯人遗体 的规定让角膜的供给大幅下降，每年排队等待角膜供体的患者数量还会大幅 增加。由此可见，构建人工角膜是中国目前的当务之急。近年来，组织工程 角膜技术的发展为角膜移植带来了希望，但理想的牛角膜基质支架仍然是角 膜体外重建的研究热点和技术难点。

在角膜载体支架方面，虽然国内外学者对羊膜、异种脱细胞猪角膜基质 等天然生物材料和复合材料进行了大量的试验研究，但真正能满足临床要求 的载体支架还是空白，已报道的异种(如猪角膜基质)经脱细胞处理后所形 成的支架也存在着结构破坏严重、透明度低、弹力差等致命缺陷。而且制备 脱细胞牛角膜基质过程中使用胰酶、乙二胺四乙酸溶液及聚乙二醇辛基苯基 醚、十二烷基硫酸钠等去垢剂，对基质中胶素蛋白等天然生物大分子制成的 膜片有很大的破坏作用，而临床报道中移植后的角膜呈明显的不透明状也印 证了这种材料的缺陷，并不能临床应用。由此可见，制备出一种透明性好、 结构致密、与人角膜细胞相容性好的基质材料是角膜临床应用的关键难题。

由此可见，制备出一种透明性好、结构致密、与人角膜细胞相容性好的 基质材料是角膜临床应用的关键难题。

发明内容

针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供一种透明性好、结构致密、 与人角膜细胞相容性好的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方 法。

为实现上述目的，本发明提供一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的 方法，包括以下步骤：

从新鲜牛眼球上切取角膜片后，并将角膜片浸泡在低渗溶液中；

由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻 融，以使细胞破碎；

依次采用缓冲液对牛角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进 行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；

将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对 牛角膜基质进行冲洗；

将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对牛角膜基质进行辐 照后，将所制备的牛角膜基质放干燥保存。

上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，上述方法的具 体步骤如下：

S1、取12小时内的新鲜牛眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环 钻切取200～500微米的角膜片，将其放于低渗溶液中浸泡30～60分钟；

S2、用手术刀刮掉角膜片的上皮层，保留前弹力层，撕掉后弹力层和内 皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻融使细胞 破碎；

S3、依次采用缓冲液对牛角膜基质漂洗2～3次、以将其放入脱细胞试剂 浸泡15～90分钟，再采用超纯水对其进行冲洗2～3次；

S4、将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂浸泡15～30分钟后，再采用超 纯水对其进行冲洗2次；

S5、将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡3～6小时后，采用剂量为 5～15KGy的钴-60对牛角膜基质辐照1～5小时后，将所制备的牛角膜基质放置 于无水氯化钙中干燥保存。

上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S1中， 低渗溶液为浓度为0.3％～0.5％的NaCl溶液。

上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S2中， 将牛角膜基质冷冻1或3小时，并解冻15～60分钟，以使牛角膜基质的细胞 破碎。

上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S3中， 缓冲液为100mmTris-HCl缓冲液，其pH值为7.5；

脱细胞试剂采用浓度为3-5g/L的碳酸氢钠溶液。