[发明专利]用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其应用

说明书

本发明公开了一种用于节肢动物多样性高通量测序复合标签及其应用，复合标签的序列如编号NO.1～NO.48所示。标签的应用方法包括：提取每一个样本的总DNA；对每一个样本，从48对且未被选择过的序列中选择任意一对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；对每个样本纯化回收后的产物进行精确定量；将所有样本等量混合后建立一个基因文库；对所建基因文库进行高通量测序。本发明提高超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中整个稻田生态系统中节肢动物种群，为探明稻田中节肢动物多样性研究提供高通量分析途径。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及用于节肢动物生物多样性高通量测序的复合标签及其应用。

背景技术

可持续的害虫调控是21世纪害虫综合治理的发展方向，也是农业可持续发展的要求(Altieri，2004)Altieri MA.Biodiversity and pest management in agroecosystems(2nd edition).New York:Food Products Press,2004:203-224。农田节肢动物生物多样性研究是害虫可持续治理中非常重要的基础性工作(Bahaar&Bhat,2011)Bahaar SWN,BhatGA.Community organization and distribution of Lepidoptera in the rice fieldsof Kashmir India.Asian Journal of Biological Sciences,2011,4(7):563-569。但在生物多样性调查中，生态系统中种类的鉴定是一个复杂而艰难的工作，传统的分类方法存在许多的不足，DNA条形码技术的发展和普及为物种分类鉴定工作提供了新的快速有效的研究方法和手段(Frézal and Leblois,2008)Frézal L,Leblois R,2008.Four years ofDNA barcoding:current advances and prospects.Infection Genetics andEvolution,8(5):727-736，也极大地促进物种分类，特别是节肢动物分类的发展(Miller,2007)Miller SE，2007.DNA barcoding and the renaissance of taxonomy.PNAS,104(12):4775-4776。因此，利用节肢动物独特的线粒体基因组细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)为靶标序列(Hebert等，2003.Hebert P,et a1.,2003.Biological identificationsthrough DNA barcodes.Proceedings of the Royal Society,270(1512):313-321)，用PCR扩增的方法从复杂样本中富集稻田节肢动物DNA，利用所扩增序列代表种的特异性来检测环境样本节肢动物多样性，成为一种非常有效的方法。

本发明所指的节肢动物线粒体基因组细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)微型条形码区域是指稻田生境中全部节肢动物COI微条形码序列的总和，为研究节肢动物多样性与环境之间的关系提供了一条新的思路。

在动物分类领域，DNA barcoding采用的标记基因主要是线粒体COⅠ基因；该基因在引物对应部分比较保守，其它序列部分变异相当大，并且容易利用通用引物进行PCR扩增；同时在近缘种间，这段基因的差异也足够大，因此适合作为动物分子鉴定的标记，也是目前在动物分子生态学上应用最广泛的分子标记。线粒体DNA(mtDNA)结构简单、几乎不发生重组、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点，被公认为是研究动物系统发育的重要标记。线粒体基因组包括13个蛋白质编码基因，2个rDNA基因，22个tRNA编码基因和一个非编码区。最常见于物种鉴定研究的mtDNA基因是细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COI)和16SrRNA基因。由于COI基因具有相对高的种间变异和低度的种内变化，以及相当长的变化序列，又容易扩增，使得COI成为能够鉴别密切相关的物种的重要DNA条形码之一。

发明内容