[发明专利]一种草分枝杆菌注射液的制备方法及草分枝杆菌注射液

说明书

技术领域

本发明涉及草分枝杆菌，特别涉及一种草分枝杆菌注射液的制备方法。

背景技术

草分枝杆菌是抗酸分枝杆菌中的一种，基于其同结核分枝杆菌的生物亲缘性，可介入人体的免疫过程，调节机体免疫系统的免疫能力。灭活的草分枝杆菌进入人体后可刺激T淋巴细胞释放出多种淋巴因子如MAF，MIF，MCF，MMF等，这些因子作用于单核巨噬细胞系统，使之向病灶部位聚集、活化，对病原菌进行吞噬、杀伤和清除；同时，自然杀伤(NK)细胞、B淋巴细胞也活化、增多；IgM，IgG趋正常，调节细胞免疫系统产生免疫功能，增强机体免疫能力。临床验证结果证明，在免疫功能检查中，T淋巴细胞亚群，T3，T4，T8，T4/T8明显增加，统计学差异显著(P＜0.001-0.002)，自然杀伤细胞，免疫球蛋白均明显变化，统计学具有显著差异(P＜0.01)，具有显著免疫增强作用。

对于草分枝杆菌的免疫增强乃至抗癌功能，目前在药学、临床学上都进行了大量的研究，在文献DE3728367C1中，披露了用草分枝杆菌对HIV感染者进行免疫接种的方法，改善HIV感染者的生存状况。

在《新的免疫增强剂——草分枝杆菌的实验和临床研究》(实用癌症杂志，2003.3，Vol.18，No.2)一文中，详细报道了临床上的草分枝杆菌对Lovo人结肠癌细胞的抑制作用》。

文献CN103396958A中，披露了一种动物用草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法，将菌种接种到种子培养基上进行种子培养后，直接进入发酵培养。这种培养方式虽然在一定程度上保证了菌种的纯度及降低了变异几率，然而，却也限制了其产量。

为了扩大草分枝杆菌的使用范围，需要一种能够工业化生产的草分枝杆菌注射液的制备方法。

发明内容

本发明提出了一种草分枝杆菌注射液的制备方法，包括以下步骤：

a)将将草分枝杆菌的原始冻干菌种溶解、用稀释的苏通培养基稀释、分装，完成原始种子批的建立，并在-70摄氏度环境下保存；

b)对原始种子批菌种进行检查，并将合格的原始种子批菌种解冻、过滤、稀释、接种于改良罗氏培养基上在30-40摄氏度的环境下培养120-150小时；

c)将步骤b)中获得的菌体进行研磨、稀释后接种于改良罗氏培养基上，在30-40摄氏度的环境下培养168-196小时，经洗脱、研磨、分装，形成主种子批菌种，并进行检验；

d)将检验合格的主种子批菌种接种于改良罗氏培养基上，在30-40摄氏度的环境下培养196-240小时，经洗脱、研磨、分装，形成工作种子批菌种，并进行检查；

e)将工作种子批菌种通过复苏、扩增形成工作种子液，将工作种子液按照体积比1-5％的接种量将工作种子液接种到发酵罐内的发酵培养基中，培养条件为35-42摄氏度，通气量为0.5-1.5L/分钟、以50-300rpm转速的条件下培养360-450小时，收集之后用0.8-1.0％的NaCl冲洗液进行冲洗、过滤，纯化、灭菌之后即获得草分枝杆菌原液；

f)以聚山梨酯80和氯化钠及注射用水混合，过滤配制成稀释液，所述稀释液中聚山梨酯80的体积百分比是0.05-0.4％，氯化钠重量百分比是0.7-1.1％，其中过滤之后的稀释液与草分枝杆菌原液混合，获得草分枝杆菌药液；

g)将草分枝杆菌药液灌封在清洁灭菌后的安瓿瓶中，终端灭菌检漏后，即为草分枝杆菌注射液。

如上所述的制备方法，其特征在于：

所述苏通培养基的配方是(单位：g/L)：天门冬素4g、枸橼酸盐2g、磷酸氢二钾0.5g、MgSO₄.7H₂O0.5g、枸橼酸铁铵0.5g、甘油-6ml；

调节PH值至弱碱性，然后采用湿热灭菌法进行二次灭活，步骤为：

对配制好的苏通培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟；

一次灭活完成后的苏通培养基，在常温下静置4小时，然后以121摄氏度的温度再次进行灭活处理35分钟，完成二次灭活处理。

如上任一所述的方法，其特征在于：

所述改良罗氏培养基的配方是(单位：g/L)：

磷酸二氢钾2.4、硫酸镁0.24、柠檬酸镁0.6、L-谷氨酸钠7.2、孔雀绿0.4、马铃薯淀粉30，并调节PH值至弱碱性，然后采用湿热灭菌法进行二次灭活，步骤为：

对配制好的改良罗氏培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟；