[发明专利]一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，具体涉及一种利用对虾 血细胞原代培养进行中草药免疫增强剂组合的快速筛选方法，属于水产养殖和生物筛选技 术领域。

背景技术

近年来由于种质资源退化和养殖环境恶化，对虾病害爆发频繁，严重制约着对虾 养殖业的发展。预防和治理病害的传统方法是使用抗生素，然而抗生素的广泛使用会导致 药物残留、菌株耐药性的产生以及环境污染等问题，最终危及人类自身的健康。因此许多学 者研究抗生素的替代物。中草药作为绿色天然药物，具有毒副作用小、多功效、不易诱发病 原菌耐药性、低污染、价格低廉、资源丰富等优势，在水产无公害养殖病害防治中具有广阔 的应用前景。

目前有关中草药免疫增强剂在生产上往往多种中草药配伍使用。而复合中草药的 使用存在添加量大、有效成分含量使用不明、作用机理不清的问题。此外，复合中草药的筛 选传统方法是采用养殖实验，实验周期长，易受外界因素影响，无法在短时间内筛选出合适 的复方中草药免疫增强剂。并且传统重复筛选方法耗费大量的时间、人力、物力以及财力。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种对虾用复方中草药免疫增强剂 的快速筛选方法。该方法能够快速和高效的筛选不同组合的中草药免疫增强剂，以克服现 有技术的不足。

为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，其特征在于，该方法包括首先制 备对虾肌肉提取液和血细胞培养基，然后分离对虾血细胞并进行原代培养，同时提取中草 药活性成分，再将中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中对血细胞进一步培养，最后 测定免疫相关指标。

所述对虾肌肉提取液的制备方法为：幼虾经暂养后，取腹部肌肉加入平衡盐进行 匀浆，匀浆后再加入平衡盐溶液进行离心，取上清再次离心，上清液经微孔滤膜过滤后即为 制备好的对虾肌肉提取液。

所述对虾血细胞培养基组成为：基础培养基为2×Leibovitz’sL-15，添加质量分 数为20%的胎牛血清和20%的所述对虾肌肉提取液，以及添加青霉素钠使其在培养基体系终 浓度为100IU·mL^-1、添加硫酸链霉素钠使其在培养基体系终浓度为100μg·mL^-1和添加两 性霉素B使其在培养基体系终浓度为100μg·mL^-1。

所述提取对虾血细胞并进行原代培养的具体操作为：首先以海水洗净对虾体表， 之后用含有青霉素和链霉素且经过高温消毒的无菌海水暂养1-2d；对对虾体表进行消毒， 然后利用吸入抗凝剂的无菌注射器按照抗凝剂：血淋巴体积比为1:1于对虾头胸甲后缘处 心脏取血，得到抗凝血样品后进行离心，弃上清得到对虾血细胞，用上述制得的培养基调节 血细胞密度并进行接种。

所述中草药选取为黄芪、杜仲、黄连和大黄。

所述中草药活性成分提取操作为：将中草药均匀粉碎后，与无水乙醇按照质量体 积比为1:10的比例混匀，70℃回流萃取1.5h，重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇 即得中草药活性成分。

所述的免疫相关指标为血细胞存活率、血细胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。

所述中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中的添加量为：每毫升培养基中添 加黄芪多糖5-30mg、绿原酸3-30mg、小檗碱5-30mg、大黄蒽醌提取物5-30mg。

所述平衡盐组成为：NaCl18.0g·L^-1、KCl0.7g·L^-1、NaHCO₃0.5g·L^-1、 KH₂PO₄0.54g·L^-1，调节pH为7.2。

所述的抗凝剂组成为：NaCl26.325g·L^-1、KCl0.745g·L^-1、EDTA-2Na 3.7224g·L^-1、HEPES2.383，调节pH为7.0，渗透压为750mOsmkg^-1。