[发明专利]一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法

权利要求书

1.一种对虾用复方中草药免疫增强剂的快速筛选方法，其特征在于，该方法包括首先 制备对虾肌肉提取液和血细胞培养基，然后分离对虾血细胞并进行原代培养，同时提取中 草药活性成分，再将中草药活性成分添加到对虾血细胞培养基中进一步培养，最后测定免 疫相关指标。

2.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述对虾肌肉提取液的制备方法 为：幼虾经暂养后，取腹部肌肉加入平衡盐进行匀浆，匀浆后再加入平衡盐溶液进行离心， 取上清再次离心，上清液经微孔滤膜过滤后即为制备好的对虾肌肉提取液。

3.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述对虾血细胞培养基组成为：基 础培养基为2×Leibovitz’sL-15，其中添加质量分数为20%的胎牛血清和20%的所述对虾 肌肉提取液，以及青霉素钠、硫酸链霉素钠和两性霉素B。

4.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述分离对虾血细胞并进行原代培 养的具体操作为：首先以海水洗净对虾体表，之后用含有青霉素和链霉素双抗的经过高温 消毒的无菌海水暂养1-2d；对对虾体表进行消毒，然后利用吸入抗凝剂的无菌注射器按照 抗凝剂：血淋巴体积比为1:1的比例于对虾头胸甲后缘处心脏取血，得到取抗凝血样品后进 行离心，弃上清得到对虾血细胞，用上述制得的培养基调节血细胞密度并进行接种。

5.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药选取为黄芪、杜仲、黄连 和大黄。

6.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药活性成分提取操作为： 将中草药均匀粉碎后，与无水乙醇按照质量体积比为1:10的比例混匀，70℃回流萃取1.5h， 重复萃取两次，合并滤液，旋转蒸发除去乙醇即得中草药活性成分。

7.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述的免疫相关指标为血细胞存活 率、血细胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。

8.如权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于，所述中草药活性成分添加到对虾血 细胞培养基中的添加量为每毫升培养基中添加黄芪多糖5-30mg、绿原酸3-30mg、小檗碱5- 30mg、大黄蒽醌提取物5-30mg。

9.如权利要求2所述的快速筛选方法，其特征在于，所述平衡盐组成为：NaCl18.0g· L^-1、KCl0.7g·L^-1、NaHCO₃0.5g·L^-1、KH₂PO₄0.54g·L^-1。

10.如权利要求4所述的快速筛选方法，其特征在于，所述的抗凝剂组成为：NaCl 26.325g·L^-1、KCl0.745g·L^-1、EDTA-2Na3.7224g·L^-1、HEPES2.383·L^-1。