[发明专利]猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及试剂盒检测技术领域，具体的说涉及一种猪流行性腹 泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒数字PCR绝对定量检测方法和检测试 剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)是世界范围内发 生的猪病之一，以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特 征。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)同属于尼多病毒目、冠 状病毒科、冠状病毒属，两种病毒的致病机理以及引起的临床症状极 其相似，给养猪业带来严重危害。这两种病的主要传染源是病猪，通 过病猪排泄出的粪便散播病毒，进而污染饲料、饮水和周围环境，健 康猪只通过口接触到含有病猪的粪便或其污染物即可发生自然感染。 而且各年龄的猪均易感染，母猪的发病率为15％～90％，而仔猪和育 成猪的发病率通常为100％。病毒传入猪群的途径主要是通过运输病 猪的车辆或者被病毒污染的饲料，以及被病毒污染的鞋、裤、衣物或 其它携带病毒的污染物。这两种病多发生于寒冷季节，主要是在每年 的11月至下年4月间发病，尤其在农历春节前后更是该病的发病高 峰期。一般情况下气温超过20℃不会流行本病，但近年来也有在夏 季发生的病例。

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于2005年～2007年间，对国 内部分省、市猪场腹泻病例进行了RT-PCR检测，结果表明，猪流 行性腹泻病(PED)病例占46％、猪传染性胃肠炎(TGE)病例占 15％、猪轮状病毒(PoRV)病例占8％，而PED、TGE和PoRV相 互间混合感染的病例占31％。各项研究都表明如何防治死亡率高的猪 流行性腹泻和猪传染性胃肠炎，是摆在我们面前的新课题。

目前,对这两种传染病的诊断方法主要有病毒中和试验,免疫荧 光法,免疫电镜法,ELISA法和RT-PCR法。随着分子生物学的不断 发展,ELISA法和RT-PCR法以其敏感性高、特异性强越来越受到人 们的重视。传统的检测方法，如病毒中和试验(VNT)、免疫荧光法、 免疫电镜法、酶联免疫吸附试验等，存在需要时间长、依赖于经验丰 富的检测人员、试验操作复杂、涉及活病毒操作、对检测环境要求较 高，以及敏感性较低和重复性较差等诸多不足。RT-PCR等核酸检测 方法，虽然较之传统方法具有特异性更强、灵敏度更高、自动化程度 更高和结果重复性更好等优势，但是仅能实现猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的定性和半定量检测，无法对 TGEV和PEDV核酸进行精确的绝对定量检测，从而检测结果无法反 映样品中病毒感染的真实情况。同时RT-PCR方法在灵敏度和特异性 上仍存在一定的局限性，对于病毒核酸提取过程中的某些化学物质较 为敏感，进而抑制PCR反应，出现“假阴性”结果。