[发明专利]猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的特 异性引物和探针组合，其特征在于，包括以下2对特异性引物和2条 与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：

PEDV-F1：CACCATCAGCACCTCTTTC；

PEDV-R1：CCAGTGCTCATGATCAAAA；

PEDV-P1：FAM-CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA-BHQ1；

TGEV-F1：CAGGGTAGTGAGTATGATTAC；

TGEV-R1：CAACCTTTGCTCTCGTAA；

TGEV-P1：HEX-ACACAGACCTCCGATACACAGC-BHQ1。

2.权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备猪流行性腹 泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂 盒中试剂的应用。

3.一种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其为双重微滴数字PCR绝对定 量检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含病毒总RNA 萃取试剂和一步法微滴数字PCR检测试剂；所述一步法微滴数字PCR 检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法ddPCR探针法预混液，探针 法ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪 流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒RNA混合液，阴性对照为无 RNA酶蒸馏水。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR 探针法预混液其900μL的配方为：500μL的2XOne-stepRT-ddPCR Supermix，PEDV上、下游引物分别为90μL，TGEV上、下游引物分 别为90μL，PEDV和TGEV的特异探针分别为20μL，引物和探针的浓 度均为10μM。

8.如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 的工作程序为：

(1)配制ddPCR反应液；ddPCR反应液20μL配方为：一步法 ddPCR探针法预混液18μL，待测样品RNA模板为2μL；

(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；

(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴， 分析数据，显示检测结果。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)中PCR 的扩增程序为50℃反转录10min；95℃预变性10min；94℃变性30 sec，54～56℃退火60sec，共40个循环；98℃10min结束反应，每步 都设置2.5℃/sec的降温速度。

10.权利要求3-9任一所述的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应 用。