[发明专利]一种罗博卢酮的生物合成基因簇及其应用

说明书

本发明提供一种托酚酮类天然产物罗博卢酮的生物合成基因簇，链霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535，从它们获得罗博卢酮化合物1‑4的制备方法，以其为活性成分的药物组合物，它们在制药中的应用。本发明所提供的包含格罗博卢酮生物合成相关的所有基因和蛋白信息，对了解罗博卢酮天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一组托酚酮类天然产物罗博卢酮的生物合成基因簇及其应用。

背景技术：

罗博卢酮为具有A、B、C、D、E五环并构的新骨架天然产物(图1)，其中A环是2,3,4,6-四取代的吡啶环，B环为环戊酮，C环为环庚三烯酚酮(tropolone)，D环和E环为糖通过糖苷键及碳碳键与环庚三烯酚酮环缩合而成。该化学结构区别于所有已知的天然产物，且到目前为止，还未有其它类似物报道。罗博卢酮A(Rubrolone A)最初是1978年Palleron小组从Streptomyces enchinoruber中分离得到的化合物。微生物次级代谢产物生物合成是由多酶体系参与的，这些多酶体系中的各个酶系按照一定的组织结构协调起作用。聚酮类化合物的生物合成通常是由生物体内的聚酮合酶利用乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A等二碳单元通过一系列的克莱森缩合(Claisen Condensation)形成聚酮链骨架，然后再经一系列的修饰和环化，最终形成结构各异的聚酮化合物。近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术，为天然产物的发现和药物开发带来了新的机遇。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上，人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基因、调控基因进行分子遗传操作和异源表达，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供化合物结构和生物活性多样化。目前现有技术中没有为罗博卢酮的生产菌链霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(Streptomyces sp.KIB-H033)的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种罗博卢酮的生物合成基因簇，同时提供链霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535(KIB-H033)，从其中获得的化合物1-4，它们的药物组合物，以及制备方法和在制药中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种托酚酮类天然产物罗博卢酮的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1的第6308～28758位的碱基序列所示。

链霉菌Streptomyces sp.CGMCC No.11535。

如所述的一种托酚酮类天然产物罗博卢酮的生物合成基因簇，该生物合成基因簇是从包含有整个罗博卢酮生物合成基因簇的科斯质粒p9B10中测序获得的，该罗博卢酮的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第6308～28758位的碱基序列所示，包含24个基因，具体为：

(1)负责罗博卢酮的酚酮七元环骨架合成的基因，即rubA、rubB、rubC、rubE1、rubE2、rubE3、rubE4、rubE5、rubE6、rubE7、rubE8、rubE9共12个基因：

rubA位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第16318-17253个碱基处，长度为936个碱基对，编码F-420依赖的氧化还原酶，311个氨基酸；

rubB位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第17831-19387个碱基处，长度为1557个碱基对，编码氧化酶，518个氨基酸；

rubC位于基因簇核苷酸序列SEQ ID NO.1第19384-20553个碱基处，长度为1170个碱基对，编码水解酶，389个氨基酸；