[发明专利]一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测引物和探针及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基 因甲基化检测引物和探针及其检测试剂盒。

背景技术

大肠癌(colorectalcancer，CRC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，近些年随着经 济的发展，人们的生活方式尤其是饮食结构的变化，肠癌已经成为我国发病率上升最快的 恶性肿瘤之一，严重威胁着国人的生命和健康。而且，晚期患者预后很差，目前，对肠癌进行 早期诊断早期治疗以提高肠癌的治愈率，降低死亡率，已经成为迫切的需要。

DNA甲基化常常是肿瘤发生发展过程中的早期事件，因此，特异基因的甲基化可作 为肿瘤早期诊断的分子标志物。NDRG4(N-mycdownstream-reguiatedgene4)为抑癌基因 NDRG基因家族成员之一，NDRG4基因长32kb，由17个外显子及16个内含子组成，大量研究表 明该基因与肿瘤细胞的生长、分化和转移有一定关系，其基因5’端调控区域含有CpG岛，在 结直肠癌发生发展过程中常常被甲基化，NDRG4基因甲基化被认为是结直肠癌的重要生物 学特征(Veerie等)。因此，NDRG4基因是候选肿瘤抑制基因和直肠癌的潜在生物标志物， NDRG4启动子的甲基化可作为生物标志物，用于早期诊断结直肠癌。

而对于NDRG4基因甲基化的检测而言，检测敏感性和特异性是尤其至关重要的因 素，对肠癌早期诊断的准确判断具有重要的意义。而检测敏感性和特异性受多方面因素的 影响，因此，对于保证和提高NDRG4基因甲基化检测敏感性和特异性的相关研究，是利用该 基因进行肠癌早期诊断的重点和难点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有利用NDRG4基因检测进行肠癌早期诊断技术 的不足和缺陷，提供一种高敏感性、高特异性的NDRG4基因甲基化检测引物和探针，而且检 测样本可使用方便获取处理的粪便样品，非常适用于临床筛查，对肠癌的早期诊断具有重 要的意义。

本发明的目的是提供一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测引物和探针

本发明的另一目的是提供一种利用上述引物和探针制备出的NDRG4基因甲基化检 测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一组用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测引物和探针，所述引物为NDRG4- 1FP和NDRG4-1RP，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和2所示；所述探针为NDRG4-2Pb，其核 苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

一种用于肠癌早期诊断的NDRG4基因甲基化检测试剂盒，包含有上述引物NDRG4- 1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb。

进一步地，上述试剂盒还包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb进 行PCR扩增时，获得PCR模板所需试剂，所需试剂包括提取待测样品DNA时捕获目的片段的捕 获探针NDRG4-CP，捕获探针NDRG4-CP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

优选地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb的使用浓度均为50～ 500μM。

更优选地，上述引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针NDRG4-2Pb的使用浓度均为100μ M。

进一步优选地，上述检测试剂盒还包括利用引物NDRG4-1FP、NDRG4-1RP和探针 NDRG4-2Pb进行PCR扩增时，PCR扩增体系试剂，包括dNTP、镁离子、反应缓冲液(buffer)、酶、 无核酸酶的水。

优选地，所述体系试剂包括5～20mM的dNTP、10～40mM的镁离子、1×～10×反应缓 冲液、酶、无核酸酶的水。

更优选地，所述体系试剂包括5～15mM的dNTP、15～35mM的镁离子、1×～10×反应 缓冲液、酶、无核酸酶的水。

最优选地，所述体系试剂包括10mM的dNTP、25mM的镁离子、5×反应缓冲液(5× buffer)、酶、无核酸酶的水。

优选地，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时，PCR体系中各组分的反应 终浓度如下：

更优选地，利用上述试剂盒进行NDRG4基因甲基化检测时，PCR体系按照如下比例 进行：