[发明专利]一种鱼肠道弧菌的LAMP检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼肠道弧菌的检测方法，具体涉及鱼肠道弧菌LAMP检测方法。

背景技术

鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)是水产养殖中新发现的一种革兰氏阴性致病菌,呈杆状,两端钝圆,散在或成双,无芽孢,可感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、石鲽(Kareiusbicoloratus)等多种名贵海水养殖鱼类，造成严重的经济损失。

目前，针对鱼肠道弧菌的检测技术主要是PCR法、DNA杂交法和菌落杂交法。然而，由于这些方法通常需要昂贵的仪器设备，且操作繁琐、费时费力，很难推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据靶序列设计四条特异性引物，可以特异性识别靶序列的六个特定区域，在等温条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换和链延伸作用，可以在1小时内对靶序列实现10⁹倍的扩增，扩增产物加入荧光染料SYBRGreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可以通过肉眼直接观察。LAMP检测方法具有特异、灵敏、快速、简便等特点，适合基层养殖场对病原的快速检测。

发明内容

本发明提供了一种鱼肠道弧菌LAMP的检测方法，目的是实现对鱼肠道弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：1、提供2对LAMP引物序列，长度分别为46bp，46bp，18bp，19bp的核苷酸序列，分别命名为ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3；2、配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳反应体系和反应条件；3、反应产物的鉴定：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。具体包括如下步骤：

1、设计LAMP引物：根据GenBank已发表的鱼肠道弧菌的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，设计合成四条引物

ToxR-FIP引物：5’-AAGCGTAACCATGCCGCCAC-TACGCGTGGTGTCTATAGCA-3’

ToxR-BIP引物：5’-AGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TGGTTTATGAATTGCCCCCT-3’

ToxR-F3引物：5’-TTTGCCGCTCAGCTAACC-3’

ToxR-B3引物：5’-CCCAACCCCAAGTTGAGTT-3’

2、配制LAMP反应体系

反应体系的终浓度为：外引物F3和B3各5mM，内引物FIP和BIP各20mM,dNTP0.25mM，Tris-Cl20mM，KCl10mM,(NH₄)₂SO₄10mM，MgSO₄4mM，0.1％TritonX-100，8UBstDNA聚合酶和1μl样品模板，加灭菌双蒸水使反应体系总体积达到25μl。

3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58到65℃，反应时间为15到90min.

4、扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。

本发明提供的鱼肠道弧菌LAMP检测方法，有以下优势：

一、灵敏度高对鱼肠道弧菌的检测灵敏度比普通PCR高100倍。

二、特异性强所需的特异性引物根据鱼肠道弧菌的ToxR基因的六个不同区域进行设计，特异性比常规PCR强。

三、检测时间段1h左右即可获得检测结果，比普通PCR省时。

四、仪器设备要求低不需要PCR仪等昂贵仪器，产物可以进行电泳，也可以直接加入SYBRGreenI染料，观察颜色变化，从而确定反应与否。

五、操作简单、结果易观察：整个检测过程不涉及复杂仪器设备，产物加入SYBRGreenI染料，可以直接用肉眼观察判断。

综上所述，本发明具有比现有的PCR技术检测鱼肠道弧菌的方法，有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在实际生产中用于现场检测，有利于及时发现鱼类养殖中的鱼肠道弧菌感染。

附图说明