[发明专利]一种鱼肠道弧菌的LAMP检测方法

权利要求书

1.鱼肠道弧菌LAMP检测方法，其特征在于包括下述步骤

(1)根据鱼肠道弧菌LuxR基因，设计并合成以下两对引物：

FIP引物：5’-AAGCGTAACCATGCCGCCAC-TACGCGTGGTGTCTATAGCA-3’

BIP引物：5’-AGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TGGTTTATGAATTGCCCCCT-3’

F3引物：5’-TTTGCCGCTCAGCTAACC-3’

B3引物：5’-CCCAACCCCAAGTTGAGTT-3’

(2)配制LAMP反应体系

反应体系的终浓度为：外引物F3和B3各5pmol/μl,内引物FIP和BIP各20pmol/μl，dNTP0.25mM,Tris-Cl20mM,KCl10mM,(NH₄)₂SO₄10mM,MgSO₄4mM，0.1％TritonX-100,8UBstDNA聚合酶和1μlDNA模板，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。

(3)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58℃到65℃，反应时间为30min到90min.

(4)扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。

2.如权利要求1所叙述的鱼肠道弧菌LAMP检测方法，其特征在于步骤3中的最适反应温度是64℃，反应时间45min。

3.一种用于鱼肠道弧菌LAMP检测的引物组，其包括以下四条引物：

FIP引物：5’-AAGCGTAACCATGCCGCCAC-TACGCGTGGTGTCTATAGCA-3’

BIP引物：5’-AGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TGGTTTATGAATTGCCCCCT-3’

F3引物：5’-TTTGCCGCTCAGCTAACC-3’

B3引物：5’-CCCAACCCCAAGTTGAGTT-3’。

4.一种用于鱼肠道弧菌LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述特异性寡核苷酸引物组、10×反应缓冲液、dNTP、BstDNA聚合酶8U/μl。

5.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述10×反应缓冲液包含：Tris-Cl200mM，KCl100mM,(NH₄)₂SO₄100mM，MgSO₄20mM，1％TritonX-100。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括SYBRGreenI显色液、阴性对照、和/或阳性对照。