[发明专利]一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于临床检验诊断学领域，涉及一种鲍曼不动杆菌快速检测试剂盒及检测 方法，特别涉及临床痰液标本中DNA提取和多重耐药鲍曼不动杆菌快速检测方法。

背景技术

鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii,Ab）是不动杆菌属中最常见的一个菌 种，是一种不发酵糖类、革兰染色阴性、无动力的球杆菌，普遍存在于自然界和人体。该菌在 医院内分布广泛且可以长期存活，是院内感染重要的条件致病菌之一，可引起呼吸机相关 性肺炎（VAP）,泌尿系统感染、菌血症、复杂的皮肤软组织感染、腹膜炎和中枢神经系统感染 等。感染多见于免疫力低下的患者，特别是重症监护病房（ICU）病人。

近年来在全球范围内鲍曼不动杆菌耐药性上升显著。世界各地大量报道了多重耐 药鲍曼不动杆菌（multi-drug-resistanceAcinetobacterbaumannii,MDR-Ab）和泛耐药 鲍曼不动杆菌（extensivedrug-resistanceAcinetobacterbaumannii,XDR-Ab）的爆发 流行。MDR-Ab是指对头孢菌素、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷以及β-内酰胺酶抑制剂， 这五类抗生素中至少三类耐药的鲍曼不动杆菌；XDR-Ab是指对上述五类抗生素均耐药的鲍 曼不动杆菌，但不包括多粘菌素和替加环素耐药；仅针对上述五类抗生素中1类或2类耐药 的敏感株鲍曼不动杆菌目前临床已较少见；多/泛耐药鲍曼不动杆菌已成为卫生保健领域 的重大课题和21世纪抗感染治疗领域的超级挑战。

产碳青霉烯酶（oxacillin-hydrolyzing，OXA）是鲍曼不动杆菌获得对碳青霉烯类 抗生素耐药的主要机制。碳青霉烯酶是指能够水解至少一种碳青霉烯类抗生素酶，本质上 仍属于β-内酰胺酶。根据该酶的分子结构可分为A类、B类和D类。D类酶目前报道最多，按氨 基酸同源性又可分为8种，在鲍曼不动杆菌中主要是4种：OXA23、OXA24、OXA51和OXA58。OXA 酶编码基因多位于细菌染色体或质粒上，由整合子或转座子介导，极易在鲍曼不动杆菌之 间发生平行传播。因此鲍曼不动杆菌OXA酶表达情况具有明显的地域性，我国目前报道的鲍 曼不动杆菌OXA基因主要有OXA23、OXA24和OXA51（[1]许顺姬等,不动杆菌碳青霉烯酶耐药 性与OXA-51基因型研究.现代预防医学[J],2015.42(5):889-891.；[2]邓德耀等,OXA- 51型β内酰胺酶的研究进展.中国感染与化疗杂志[J],2014.14(5):451-454.；[3]张伟 红等,耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药表型和碳青霉烯酶基因型分析.中国感染与化疗杂 志[J],2011.11(1):45-48.）。

我国由于临床长期经验性和广泛性使用广谱抗生素，造成近年来鲍曼不动杆菌的 分离率和耐药率显著升高，并已从单一抗生素耐药发展成为多重耐药，成为医院感染的重 要病原菌之一。国内通常使用亚胺培南+β-内酰胺酶抑制剂复合制剂治疗鲍曼不动杆菌感 染，但目前鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药性已非常严重。对于耐亚胺培南鲍曼不动杆菌治 疗则使用替加环素，该药物成本高昂且已发现鲍曼不动杆菌有耐替加环素的趋势，因此临 床鲍曼不动杆菌治疗需要科学合理的选择抗生素。目前临床只能通过细菌培养和药敏实验 的方法检测鲍曼不动杆菌耐药性，该方法至少需要72h，远不能适应临床治疗的要求，急需 一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法（[1]李玉梅等,医院细菌分离培养及药敏试验结 果分析.中国公共卫生[J],2015.31(3):383-384.；[2]张利元等,医院感染的细菌分布 及药敏检测分析.中国现代医学杂志[J],2012.22(25):86-89.）。

发明内容

本发明实施提供一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法，用于解决临床快速评估 鲍曼不动杆菌耐药性，并指导临床合理使用抗生素。

本发明根据鲍曼不动杆菌OXA24（GeneBank:AJ239129.2）和OXA51（GeneBank: AJ309734.2）基因序列设计PCR引物，采用多重PCR方法检测100株鲍曼不动杆菌（其中多重 耐药菌50株，敏感菌50株），经检测发现多重耐药鲍曼不动杆菌均表达OXA24基因片段和 OXA51基因片段，敏感菌株仅表达OXA24基因；以此建立从临床痰液标本中提取基因组DNA的 方法；通过多重PCR快速检测临床标本中鲍曼不动杆及其耐药性。

其中，针对鲍曼不动杆菌OXA24基因引物序列为：