[发明专利]一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）基于鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计多重PCR扩增引物；

（2）待检痰液标本或血液标本基因组DNA抽提；

（3）使用步骤（1）所述的引物进行多重PCR技术扩增待检样本DNA；

（4）对PCR结果进行电泳检测。

2.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌 为多重耐药鲍曼不动杆菌和敏感株菌，其中所述多重耐药鲍曼不动杆菌均表达OXA24基因 片段和OXA51基因片段，敏感菌株仅表达OXA24基因。

3.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的 多重PCR扩增引物序列如下所示：

针对鲍曼不动杆菌OXA24基因引物序列为：

Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，

Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；

PCR产物预测长度为246bp；

针对鲍曼不动杆菌OXA51基因引物序列为：

Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,

Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；

PCR产物预测长度为353bp。

4.权利要求1步骤（2）中所述的痰液标本基因组DNA抽提方法，其特征在于，具体步骤 包括：在痰液标本中加入等体积NaOH溶液，于水浴中放置使痰液充分液化；然后将液化后痰 液离心，收集沉淀用于鲍曼不动杆菌基因组DNA提取；加入溶菌酶于37℃静置10min裂解细 菌；再加入蛋白酶K于60℃消化10min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用酚：氯仿法抽 提细菌基因组DNA。

5.根据权利要求4所述的痰液标本基因组DNA抽提方法，其特征在于，所述NaOH溶液浓 度为1mol/L；所述水浴条件为60℃水浴10min；所述溶菌酶浓度为10mg/mL；所述蛋白酶K浓 度为20mg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的 多重PCR扩增体系包括：12.5μL的2×PCRMix预混液、各种引物上下游各0.2μL（引物浓度 均为10μmol/L）、痰液或血液中提取基因组DNA2μL、灭菌双蒸水9.8μL。

7.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述的 多重PCR扩增反应条件为：在94℃下预变性5min后，进行以下扩增循环：在94℃下变性25s， 在53℃下退火40s，在72℃下延伸40s，反应进行40个循环后，在72℃下延伸10min。

8.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述的 电泳检测为：通过1%琼脂糖凝胶电泳分析反应结果，若电泳结果含有246bp（OXA24）和353 bp（OXA51）两个条带则确定为检测出含有多重耐药鲍曼不动杆菌，若电泳结果仅有246bp （OXA24）一个条带则确定为检测出含有敏感菌株。

9.一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：DNA抽提试剂、2对多 重PCR扩增引物、2×PCRMix预混液、灭菌双蒸水；其中所述2对多重PCR扩增引物如下：

Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，

Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；

Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,

Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’。

10.一种痰液DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1mol/LNaOH溶液、10mg/ mL溶菌酶、20mg/mL蛋白酶K、酚-氯仿法DNA抽提试剂。