[发明专利]一种人体肠道十大优势菌定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种人体肠道十大优势菌定量检测试剂盒，其特征在于，包括标本采集管、厚壁管、 BufferA、10%SDS、2*SybGreenPCR预混液、标准品、阴性质控品和阳性质控品，所述标本 采集管有50支，规格为500±50mg，内含2ml粪便DAN稳定剂；所述厚壁管有50支，规格为2ml； 所述BufferA有1瓶，规格为500ml，其主要成分为氯化钠和Tris-Hcl；所述10%SDS有一支， 规格为10ml，其主要成分为10%十二烷基硫酸钠；所述2*SybGreenPCR预混液有10份，规格 为1200ul/管，其主要成分为反应缓冲液、SybGreen荧光染料、DNTPs、引物；所述标准品有10 支，规格为10¹¹拷贝数/每支，标准品内含人工构建的质粒；所述阴性质控品有2份，规格为 500ul/管，其主要成分为生理盐水；所述阳性质控品有10分，规格为500ul/管，其主要成分 为已知拷贝数的灭活的克隆菌培养液；所述试剂盒在使用时需准备无水乙醇、酚、酚-氯仿- 异戊醇、氯仿-异戊醇以及样本均质器和离心机。

2.根据权利要求1所述的人体肠道十大优势菌定量检测试剂盒，其特征在于，其使用步 骤方法为：

（1）样本采集：

使用样品采集托盘留取好粪便；旋下样本采集管管帽，取出与管帽相连接的定量采集 器；将采集器下端垂直于样品采集托盘中的粪便按压几次，确认粪便充满整个采集器；将采 集器放回样品采集管，旋紧管帽；按压管帽上部突出装置，使粪便掉入管体下部DNA保存液 中，然后剧烈晃动几次，确保混匀；贴上相应信息标签，完成采样；

样本处理与DNA提取：

称量0.3g硅胶珠（直径0.1mm）加入厚壁管中；将粪便标本从采集管中转移到厚壁管中 （体积大概为1.2ml），加入BufferA400ul，同时加入酚150ul；样品均质器击打两次；放入- 80℃冰箱中10min，随后60℃温浴2min，混匀；冻融后冰上放置1min；加入110ul10％SDS冰 上放置10min；混合液加入150ul氯仿-异戊醇（v/v,24:1），15g，离心5min取上清；上清分别 用等体积的酚、酚-氯仿-异戊醇（v/v,25:24:1）、氯仿-异戊醇(v/v,24:1)各抽提2次、2次、1 次，每次均15g离心5min取上清；氯仿-异戊醇抽提之后，上清加入1/10体积的醋酸钠（3M, pH5.2）；用2倍体积的无水乙醇沉淀过夜；沉淀过夜之后，15g离心10min后，真空干燥或者于 烘箱干燥10min，溶于300ul无菌水中；

PCR扩增：

取N个（N=阴性质控品+待测样本+阳性质控品）PCR反应管，每管分别加入2×SybGreen PCR预混液反应液10ul、引物1.2ul(上、下游引物分别为0.6ul)、ROX0.5ul、去离子水 7.3ul、模板1ul（也可按照每人份的用量，计算2×SybGreenPCR预混液、引物、ROX、去离子 水各自所需总量，三者混匀后分装19ul于单个PCR反应管中）；于上述PCR反应管中分别加入 处理后的阴性质控品、待测样本混浊液（请吸打混匀后吸取）、阳性质控品及标准品1ul 3000rpm离心30秒，放入PCR扩增仪；设置循环条件为，94℃3分钟，1个循环；93℃15秒→60℃ 45秒，40个循环(每个循环结束后读取反应管的荧光值)；设置完成后，保存文件，运行程序；

结果换算：

报告所定义的值＝定量检测结果／该样本DNA浓度，即为每ng粪便微生物总DNA中所含 待测菌的DNA拷由贝数。