[发明专利]快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法

说明书

本发明公开一种快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其包括以下步骤：(1)使用凝胶将从样品中提取的总蛋白质进行梯度分离；(2)将已梯度分离的总蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜；(3)将印迹有所述总蛋白质的PVDF膜浸泡在100％甲醇中；(4)干燥经100％甲醇处理的所述PVDF膜；(5)对干燥的PVDF膜中的目标蛋白质进行显色检测。本发明快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法提高低丰度蛋白质的检测效率，提供了更实用、更灵敏、更快速的检测手段。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质检测方法，尤其涉及一种无封闭的蛋白质印迹法，适用于快速检测低丰度蛋白质。

背景技术

蛋白质印迹(western blot，简称WB)又称免疫印迹(immunoblotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，已成为当前分析蛋白质的常用分子生物学技术。

在蛋白质印迹过程中，经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过从PAGE胶转移到膜上固定，为了避免测试试剂的特异性抗体与膜发生非特异性结合，需要对膜上的潜在结合位点进行封闭处理；后续进行Western Blot的检测和显色。

蛋白质印迹常规流程：蛋白提取与样品制备——SDS-PAGE电泳——转膜——封闭——抗体杂交——底物染色。具体包括以下步骤：

1.提取样本总蛋白，并浓缩纯化，用超微量核酸蛋白浓度仪器测定样品提取液蛋白浓度。

2.按样本总蛋白梯度20mg进行上样，变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白。

3.目标蛋白质转移到PVDF膜。按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层。30mA恒流条件下，4℃转移过夜。

4.为了避免测试试剂的特异性抗体与膜发生非特异性结合，需要对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。加入封闭液后，一般在室温或者37℃在摇床上缓慢震荡1-2h，特殊情况在4℃过夜。

5.封闭完成后要洗膜，去除膜上未结合的封闭试剂。常规的洗涤液为TBST，洗3次，每次15分钟。

6.抗体孵育。膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。用TBST洗涤3次，每次15分钟。封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5小时，抗原抗体结合，用TBST洗涤3次，每次15分钟。再加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。用TBST洗涤3次，每次15分钟。

7.压片显影定影后观察。

每种动物细胞中所含的蛋白质一般占到7％--10％左右，谷类一般含蛋白质6％-10％，薯类含蛋白质2％-3％。而在花生组织中蛋白质含量虽然有15％左右，但杂质多，如色素，酚类和糖类多，影响蛋白质的提取。进一步地，植物蛋白质与动物蛋白质比较，成分有所不同，如水稻蛋白缺乏赖氨酸，大豆蛋白缺乏色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等。因此，一般情况下，要分析的植物目标蛋白质在植物总蛋白质比例较低，采用常规的蛋白质印迹法进行检测常常效果差，蛋白曝光显影弱或者不出现显影，灵敏度低。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种更实用、更灵敏的针对低丰度蛋白质的蛋白质印迹法。

为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种快速检测低丰度蛋白质的无封闭的蛋白质印迹法，其包括以下步骤：

(1)使用凝胶将从样品中提取的总蛋白质进行梯度分离；

(2)将已梯度分离的总蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜；

(3)将印迹有所述总蛋白质的PVDF膜浸泡在100％甲醇中；