[发明专利]一种利用基因组改造的重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法

说明书

技术领域

一种利用基因组改造的重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法，属于微生物基因 工程领域。

背景技术

L-脯氨酸(L-Proline)是一种亚氨基酸，L-脯氨酸是合成人体蛋白质的重要氨基 酸之一，它是一种非极性氨基酸，当它整合到蛋白质中时，形成叔酰胺从而破坏蛋白质中的 α螺旋和β折叠片结构，在医药、化工、食品、农业等领域具有广泛的用途。

随着我国医药卫生水平的提高以及化学合成工业、农业的发展，对L-脯氨酸的需 求也日益增长，良好的应用前景使得L-脯氨酸生产技术的研究受到广泛的关注。L-脯氨酸 的生产方法主要有三种：化学法、水解提取法和微生物发酵法。其中，通过化学法以及水解 提取法生产L-脯氨酸过程复杂，效益低，成本高，微生物发酵法以其成本低，污染少，杂质 少，纯度高等优势在工业生产中日益占主导地位。

在微生物体内，L-脯氨酸的生产过程是，由α-酮戊二酸形成的谷氨酸，经谷氨酸激 酶(proB编码)催化下由ATP提供磷酸基团形成谷氨酰磷酸，又在谷氨酸脱氢酶(proA编码) 作用下将谷氨酸的γ-羧基还原成谷氨酸-γ-半醛，然后自发环化形成五元环化合物△’二 氢吡咯-5-羧酸，再由二氢吡咯还原酶(proC编码)催化形成脯氨酸。其中脯氨酸能够反馈抑 制谷氨酸激酶，而且proB与proA是作为一个操纵子proBA进行表达的，将proBA突变成 proB₂A后能够降低脯氨酸的反馈抑制，大量生产L-脯氨酸。将proB₂500替换掉重组大肠杆菌 基因组中的proB500，能够进一步的提高L-脯氨酸在微生物内的积累量，而且该性状能够随 着微生物的传代而稳定存在。

发明内容

本发明通过构建合适的基因组改造的重组大肠杆菌，在大肠杆菌中过量表达该谷 氨酸激酶，并能在发酵培养基中以葡萄糖为碳源，来直接获得大量的L-脯氨酸，工业应用前 景广阔。

本发明所述的通过构建合适的重组大肠杆菌基因改造菌发酵生产L-脯氨酸，其特 征在于，通过酶切获得具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因proB₂A与质粒pET28a相连，构建重 组质粒pET28a-proB₂A，然后将PCR获得的proB₂500替换掉重组大肠杆菌基因组中的 proB500，构建好的基因组改造的重组大肠杆菌能在合适的培养基中，与合适的培养条件下 发酵生产L-脯氨酸。

本发明中的具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因proB₂A从实验室已有的载体上酶切 获得，片段proB₂500是依proB₂A为模板，设计合适的引物，通过PCR获得的。

本发明所述大肠杆菌可以是E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)ΔputA以及 E.coliJM109等。

本发明中的表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pET-28a、pKYP10、 pUC19、pAMP、pBR322等。

本发明中为了使具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因能够在重组菌中稳定存在表 达，用片段proB₂500替换掉重组菌基因组上的proB500

本发明可以应用于L-脯氨酸的生产中，培养重组菌的培养基要含有微生物可以利 用的碳源、氮源、无机盐等，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。

本发明中发酵培养基中的碳源，有葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油等。

本发明中发酵培养基中的氮源，可以是氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐类或其他含 氮化合物，还可以有酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕等有机氮源。

本发明中发酵培养基中的无机盐，有磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化 钙等。

重组菌的培养需要震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量。培养温度在20-37 ℃，培养时间12-72小时。

本发明的方法是通过基因组改造的重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸，具有广阔的 工业应用前景。

附图说明

图1是重组载体pET28a-proB₂A构建图。