[发明专利]一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白 滴眼液及其制备方法和应用。

背景技术

病毒性角膜炎是受病毒致病原感染角膜而引起的炎症，当身体抵抗力减退时，如感冒或 高热等，容易诱发该病反复发作，每次发作视力就下降一点，严重的最后会导致失明。在临 床治疗中常用抗病毒眼药水，配合抗菌素眼药水，以防继发细菌或真菌感染，有虹膜反应时， 则加扩瞳药，根据患者体质情况，衰落者或易感冒者，常辅以提高免役的药物。目前常用于 病毒性角膜炎治疗预防的眼药水主要是包含抗生素类药物的眼药水，包括：氧佛沙星、阿昔 洛韦、利巴韦林等，现有技术中存在采用金银花、野菊花等中草药制成熏眼制剂以治疗病毒 性角膜炎的方案，但是，添加的为中药通过煎煮得到的药液，会让很多的有效成分失活，总 体是成分不明确，制备方法过于简单，高温易使有效成分失活，治疗效果不明显。

病毒性角膜炎：病毒性角膜炎是受病毒致病原感染角膜而引起的炎症。角膜浅层有丰富 的三叉神经末梢，故该病常有明显的刺激症状，有畏光、流泪、酸痛等。病毒性角膜炎可由 多种病毒引起，其临床表现轻重不等，对视力的损害程度视病变位置、炎症轻重、病程长短、 复发次数和有无混合感染而不同。临床上常见的病毒性角膜炎有单纯疱疹性角膜炎、牛痘性 角膜炎、带状疱疹性角膜炎等。

NK细胞及分泌的蛋白因子：NK细胞即自然杀伤细胞(naturalkillercell)，是机体重要 的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应 和自身免疫性疾病的发生。NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀 伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正 相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤 效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自 身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素， 也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。在体外，NK可溶解疱疹病毒、牛痘病毒、麻 疹病毒、腮腺炎病毒、巨细胞病毒和流感病毒感染的靶细胞。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白 滴眼液，针对病毒性角膜炎治疗中通过消炎、抗病毒为主的治疗方式进行制备，成分明确， 针对性强，效果明显。

本发明的另一目的是提供一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液的制备方 法。

本发明的再一目的是提供一种的NK细胞分泌的蛋白滴眼液用于治疗病毒性角膜炎的用 途。

本发明通过以下技术方案实现该目的：

一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液，包括以下组分：

一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤：

NK细胞的扩增培养：

1)采集患者自身外周血20～40mL，200～600g离心10min后收集上层血浆备用；

2)将下层血细胞用2倍体积的生理盐水进行稀释，再将稀释血液缓慢加入淋巴细胞分离 液上层，使分层清晰，稀释血液与淋巴细胞分离液的体积比为2:1；

3)400～700g离心30min，提取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，200-500g离心 5min，计数；

4)加入X-VIVO15无血清培养基，使得细胞密度为1～10×10⁵cell/mL，添加5％自体血 浆、100～1000U/mL的IL-2、100～1000U/mL的IL-15、100～1000U/mL的IL-21、50～500U/mL 的CD3单抗；

5)培养过程中每3天补液一次，并添加100～1000U/mL的IL-2、100～1000U/mL的IL-15， 使得细胞密度维持在1～10×10⁵cell/mL；

6)培养12～14天，收集NK细胞悬液，200～500g离心10min，收集上清液；

NK细胞培养液的纯化与冻干：

7)将收集的上清液采用切向流器，循环过滤浓缩至少3h，经0.45μm滤膜过滤除去大 颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤除去3kDa以下小颗粒物质；