[发明专利]一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液，包括以下组分：

2.一种治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤：

NK细胞的扩增培养：

1)采集患者自身外周血20～40mL，200～600g离心10min后收集上层血浆备用；

2)将下层血细胞用2倍体积的生理盐水进行稀释，再将稀释血液缓慢加入淋巴细胞分离 液上层，使分层清晰，稀释血液与淋巴细胞分离液的体积比为2:1；

3)400～700g离心30min，提取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，200-500g离心 5min，计数；

4)加入X-VIVO15无血清培养基，使得细胞密度为1～10×10⁵cell/mL，添加5％自体血 浆、100～1000U/mL的IL-2、100～1000U/mL的IL-15、100～1000U/mL的IL-21、50～500U/mL 的CD3单抗；

5)培养过程中每3天补液一次，并添加100～1000U/mL的IL-2、100～1000U/mL的IL-15， 使得细胞密度维持在1～10×10⁵cell/mL；

6)培养12～14天，收集NK细胞悬液，200～500g离心10min，收集上清液；

NK细胞培养液的纯化与冻干：

7)将收集的上清液采用切向流器，循环过滤浓缩至少3h，经0.45μm滤膜过滤除去大 颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤除去3kDa以下小颗粒物质；

8)将步骤7)收集的浓缩液经冻干机制成NK细胞培养冻干粉；

含NK细胞蛋白因子滴眼液的制备：

9)取无菌注射用水加热煮沸，加入硼酸、硼砂溶解后冷却至40℃；

10)加入氯霉素、羟苯乙酯搅拌溶解，再加入NK细胞培养冻干粉，最后添加无菌注射 用水定容，制得治疗病毒性角膜炎的NK细胞分泌的蛋白滴眼液。

3.一种NK细胞分泌的蛋白滴眼液用于治疗病毒性角膜炎的用途。