[发明专利]用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒，其中引物及探针包括突变上游ARMS引物PM1‑F，与D842V(2525A>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列，突变下游引物PW1‑R，与PDGFRA基因保守序列结合；5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针PW1‑P，能与扩增片段结合；以及5’端双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针PW1‑B，能与D842V位点野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异扩增。本发明的引物及探针特异性高、灵敏度好，检测能力高达1％。由其制备的试剂盒检测结果准确易读，操作简单快速，适用范围广。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物、探针及试剂盒。

背景技术

胃肠间质瘤(gastrointestinal stroml tumor，GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势。主要发生于胃肠道、大网膜和肠系膜，占所有胃肠道肿瘤的0.2％，占胃肠道肉瘤的80％，C-kit受体(又称CD117)基因通常呈阳性表达。对绝大多数患者来说，基因突变是肿瘤形成的关键，其中CKIT基因突变占80-85％，PDGFRα突变占7％，野生型(未检测到突变)占10-15％。GIST患者手术切除后容易复发，中位复发时间约为2年，仅有10％的患者长期随访未见复发。

血小板衍生生长因子受体(Platelet-derived Growth Factor Receptors,PDGFR)是一种调节细胞生长的跨膜蛋白，属于III型酪氨酸激酶家族，主要分布于平滑肌细胞，内皮组织细胞、成纤维细胞和胶质细胞。PDGFR在调节细胞增殖、分化和新血管形成等方面发挥重要调节作用。PDGFR通过与信号分子结合后形成受体配体复合物并活化PDGFR，进而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信号通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，进而调节肿瘤细胞的分裂和增殖。

甲磺酸伊马替尼(格列卫)是一种分子靶向药物，用于治疗不能切除或发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤，在GIST的治疗中取得了非常好的疗效。目前，对于术后复发或转移的GIST患者，如果存在高危因素或不能进行手术治疗，甲磺酸伊马替尼(格列卫)是标准的一线药物，当格列卫用药过程中不能耐受，或出现疾病广泛进展(generalized progression)时，二线药物应用苹果酸舒尼替尼(索坦)。

有研究表明，携带有PDGFRA基因D842V突变的GIST患者对伊马替尼耐药。在一项对携带PDGFRA突变的GIST患者的生存结局进行报道的国际调查中，在D842V突变的31例可评估患者中无一例获得疾病应答(imatinib)，21例(68％)发生疾病进展。

目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的方法灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。

发明内容

为了解决现有检测技术出现的灵敏度低、检测时间长、检测效率低、样本易污染、假阳性率高等问题，本发明提供了用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，灵敏度高，特异性强，有效避免假阳性。本发明还提供了包括上述引物和探针的试剂盒，检测方便快速，操作简单，结果易读，适用范围广。

本发明提供的用于检测人类PDGFRA基因D842V突变的引物和探针，核苷酸序列如下：

突变上游ARMS引物PM1-F：SEQ ID NO:1，

突变下游引物PW1-R：SEQ ID NO:2，